シスチン症および原発性高シュウ酸尿症の遺伝子新生児スクリーニング (GENESIS)

背景と目的。 人口ベースの新生児スクリーニング (NBS) は、早期発見を通じていくつかの病気の経過を大幅に改善した重要な公衆衛生プログラムです。 スクリーニングされた障害の選択は、一般に、ウィルソンとユングナーによって概説された 10 の原則に従います。 ドイツでは、NBS は 1969 年以来、現在 17 の障害をカバーする任意の国民健康サービス プログラムです。 新生児の乾燥血液スポットのタンデム質量分析を使用する現在の NBS メソッドは、治療可能な多くの遺伝的状態を検出できません。 同時に、乾燥した血液スポットから DNA を抽出できるようになり、次世代シーケンシングが経済的になり、遺伝子データベースがより洗練され包括的になるにつれて、分子診断の信頼性と妥当性が高まるため、分子ベースの NBS はますます実現可能になっています。 腎症性シスチノーシスと高シュウ酸尿症 (PH) は、効果的な治療法が利用できるため、分子ベースの NBS の対象となります。

最初のパイロット プロジェクトでは、シスチン症に対する NBS の科学的根拠がすでに確立されている可能性があります。 この研究の目的は、シスチン症の遺伝的 NBS が他の研究所に移転可能であることを実証し、PH のスクリーニングの科学的根拠を確立することです。

具体的には、この研究では、これらの疾患を一般的な NBS に含めることが推奨されるべきかどうかを調査します。 特定された乳児を、パイロットプロジェクト以外で症候的に診断された患者と比較して観察することにより、早期の診断と治療がより好ましい予後につながるかどうか、またどの程度までつながるかが判断されます。

シスチノーシス 腎症性シスチノーシスは、リソソームからのシスチンの輸送障害によるもので、出生 100 ～ 200,000 人に 1 人の割合で発生します。 生後 1 年の腎臓ファンコニ症候群と、約 10 歳までに末期腎疾患に進行する糸球体機能障害を特徴とします。 経口システアミン療法による治療は糸球体機能の維持に役立ちますが、罹患した個人は最終的に腎代替療法を必要とします.システアミン治療は通常、生後2年目の診断時に開始されますが、それまでに糸球体および尿細管の損傷がすでに発生しています. この状況は、生後すぐに患者を診断し、分子遺伝学に基づく新生児スクリーニングを採用することで改善される可能性があります。 新生児スクリーニングのための標準的な質量分析ベースの方法では、シスチノーシス白血球のシスチン含有量の増加を検出できません。

シスチノーシスのスクリーニングでは、ドイツで最も一般的な 3 つの CTNS 変異のうち 2 つを検出するために、最初の段階でマルチプレックス PCR が行われました。 ヘテロ接合体のサンプルは、175 の病原性 CTNS 変異のアンプリコンベースの次世代シーケンシングに提出されます (Labor Limbach, Mainz)。 このアプローチを使用すると、96.5% の検出率が予測されます。

原発性高シュウ酸尿症 グリオキシル酸代謝における 3 つの異なるデフォルトが PH につながります。 重症型 PH1 は最も一般的なバリアントです (106 人の患者のうち 1 ～ 3 人)。 人口ベースの研究では、有病率は 1:58,000 と推定されています。 報告されていない症例の推定数は多い。 シュウ酸カルシウム結晶が腎臓に沈着すると、慢性炎症が引き起こされ、最終的な腎不全を引き起こします。 尿中のシュウ酸排泄が減少すると、血漿中のシュウ酸濃度が高くなり、続いて臓器や組織にシュウ酸カルシウムが沈着します（全身性シュウ症）。 臨床経過は非常に多様です。 早期の腎機能喪失を伴う乳児シュウ症から成人期の無症候性患者までの例が記​​載されています。

臨床的には、PH2 の方が穏やかですが、約 50% の患者が末期腎不全を発症します。

PH3 は以前は軽度のバリアントと見なされていましたが、今日、PH3 患者は小児期に腎結石を発症し、全身性シュウ症を伴う末期腎不全を発症する可能性があることが知られています。

OxalEurope (ヨーロッパの高シュウ酸尿症コンソーシアム) の PH レジストリには、現在、PH1 の 81.9%、PH2 の 9.8%、PH3 の 8.4% を含む、1137 人の遺伝的に診断された患者がリストされています。 ドイツ登録簿の分子遺伝学的評価では、PH1 が 74.1%、PH2 が 7.9%、PH3 が 17% という結果が得られました。

これまでのところ、原発性高シュウ酸尿症は、尿分析（または末期腎不全の場合は血漿検査）による臨床所見に従って診断されています。 したがって、診断は通常、患者がすでに末期腎不全を発症してから行われます。 しかし、既存の医薬品 (ビタミン B6) または新しい RNAi 医薬品 (Lumasiran、Nedosiran) は腎不全を予防し、この疾患を治療可能にしています。 このパイロット プロジェクトの目的は、AGXT 遺伝子と HOGA1 遺伝子の最も一般的な変異を特定することです。

ワークフロー 研究人口 ドイツの病院は、NBS の 11 の認定検査室から自由に選択できます。 このプロジェクトでは、ハノーバーのスクリーニング研究所が、シスチノーシスと PH の遺伝子スクリーニングによって、日常的に確立されている NBS を拡張する可能性について送信者に通知します。

研究集団には、両親がパイロットプロジェクトへの参加を希望し、書面によるインフォームドコンセントを提供した新生児が含まれます。

親の情報と同意 スクリーニングを実施する前に、NBS を担当する医師 (婦人科医、小児科医) から、さまざまな疾患のスクリーニングの可能性について、新生児の両親に包括的に説明されます。 シスチノーシスと PH スクリーニングに関する追加情報と同意書は、通常の NBS で既に利用可能な情報パンフレットに挿入されています。 同意書には、少なくとも 1 人の親の署名と、情報を提供した医師の署名が記載されている必要があります。 パイロットプロジェクトの同意書には、異常なスクリーニング結果が発生した場合に、連絡先データと調査結果を専門のセンターに転送することへの同意も含まれています。 ラボは、分析の前にプロジェクトの同意書を受け取る必要があります。 正常であることが判明した結果は、子供のための NBS ガイドラインに従って、担当の提出医師に報告されます。 差出人は、スクリーニングのために採取された各血液サンプルの結果があるかどうかを確認する必要があります（結果返送管理）。

肯定的な結果が得られた場合、検査室は最初に送信者に通知し、子供がまだ入院しているかどうかを明確にする必要があります。 その場合、送信者は親から最初の情報を取得し、それぞれの診断について専門家に通知します (シスチン症: Priv.-Doz. 医学博士。

K.ホーエンフェルナー、ローゼンハイム。高シュウ酸尿症: Prof. Dr. med. B.ホッペ、ボン）。 子供がすでに退院している場合、研究所はインフォームドコンセントの対象となる関連する専門家に直接連絡します。

サンプリング 分子遺伝学的スクリーニングは、通常の NBS と同じ乾燥血液スポット カードを使用して実行されます。

一般に、すべての無効な結果 (つまり、コントロール反応が失敗した場合) およびすべての異常な結果 (シスチン症: 57 kb 欠失および/または c.18_21delGACT、p.T7Ffs*7 ; PH1、c のホモ接合体またはヘテロ接合体) について.508G>A、PH3、C700+5G>T、ホモ接合体および/またはヘテロ接合体) 検査は、既存の血液サンプルを使用して確認のために内部的に繰り返されます。

測定と方法 上記の 4 つの変異について、リアルタイム quadruplex PCR を実行します。 シスチン症：検出は、結合の検出または蛍光標識プローブの融解分析によって行われます。 ヘテロ接合変異による陽性結果のサンプルでは、​​シスチノシン遺伝子 (CTNS) のエクソンは、アンプリコンベースの方法で次世代シーケンシング (NBS) を使用してシーケンスされます。 これにより、目的のエクソンのみが検査され、他の DNA 領域は検査されません。 リアルタイム マルチプレックス PCR 用に抽出済みの DNA は、NBS に使用できます。 NEBNext Direct Genotyping Solution を使用すると、CTNS 遺伝子の解析可能なすべての領域がカバーされ (部分的に重複)、すべてのエクソンと特定のイントロンの完全な配列情報が保持されます。 したがって、DNA は酵素的に断片化されてから、発光アダプターと連結されます。 アダプターには個別のインデックスが含まれています。 その後、ビオチン ビーズは、ターゲットの濃縮に使用されます。 それらはストレプトアビジンビーズで増強されます。 その後、オフターゲット シーケンスが削除され、ライブラリが PCR によって増幅されます。 実際の配列決定は、イルミナのデバイス (MiniSeq) を使用して実行されます。 配列は、参照配列との自動比較を実行するソフトウェアを使用して評価され、それによって突然変異が検出されます。

PH: 検出は、蛍光タグ付きリードを使用した熱分析によって行われます。 肯定的な結果が得られた場合 (これもヘテロ接合性星座による)、ドイツの高シュウ酸尿症センターと協力して明確化が計画されています。 したがって、スポット尿は、シュウ酸およびグリオキシル酸代謝のさらなるパラメーターについてテストされます。

検査結果 シスチノーシス：最も頻度の高い CTNS の変異がホモ接合性または複合ヘテロ接合性変異として検出された場合、シスチン症スクリーニングは陽性と見なされます。 次世代シーケンシングを使用して、文献に記録されている追加の 175 の突然変異が検出されます。 他のすべてのケースでは、ヘテロ接合状態に関係するケースでも、シスチノーシスのスクリーニングは正常です。

PH: PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) および/または PH3 (HOGA-gene: c.700+5G>T) がホモ接合体で検出された場合、高シュウ酸尿症スクリーニングは陽性です。 スクリーニングが陽性のヘテロ接合体の遺伝的保因者では、ケルン（ケルン）のウィスプリングホフ研究所で実施されるその後の尿検査により、所見が明らかになります。

検出率、偽陽性および偽陰性の結果 両方の疾患について、95% を超える全体的な検出率が想定されます。 偽陰性のスクリーニング結果はほとんどありません。

シスチノーシスの場合、これまで知られていなかったまれな変異、または最も頻度の高い 2 つの変異のいずれも持たない患者による偽陰性の結果が生じる可能性があります。

偽陽性のスクリーニング結果もほとんどありません。 シスチン症では、「対立遺伝子ドロップアウト」（プライマー結合領域の変異による対立遺伝子の PCR 失敗）によるヘテロ接合サンプルが誤ってホモ接合に見える場合があります。

PHでは、ヘテロ接合変異の場合に疾患が除外されないため、さらなる診断が必要であり、計画されています。

対応する症状の場合、シスチン症または PH を鑑別診断に含める必要があります。鑑別診断は通常、数少ない治療センターの 1 つで行われます。 このようなケースは、出席センターのフィードバックを介して時間の経過とともにのみ文書化できます。

診断の確認 シスチン症: CTNS遺伝子にホモ接合性または複合ヘテロ接合性の変異を有する患者では、EDTA血液2.3mlから白血球内シスチンレベルを測定することにより、診断が確認されます。 このサンプルは、生後 14 日以内にハイデルベルクの代謝研究所に送られます。

PH: PH1 または PH3 遺伝子の突然変異のホモ接合保因者では、ドイツの高シュウ酸尿症センターで実施されるスポット尿または血漿の対照検査が続きます。

検証テストの結果は、品質管理のためにスクリーニングラボに転送されます。

罹患した子供のケア シスチン症: シスチン症のスクリーニング結果が陽性の子供とその両親は、最寄りの代謝性疾患センターに紹介されます。 システアミンによる治療は、診断の確認後すぐに開始できます。 保護者は、ローゼンハイムでの学際的なシスチノーシス相談の可能性について通知されます。

PH: スクリーニング結果が陽性の子供は、主にボンにあるドイツの高シュウ酸尿症センターに紹介されます。

これらの患者のさらなる治療は、患者が選択した最寄りの病院で行われます。

プロジェクトの規模 財政上の理由から、プロジェクトは 200,000 サンプルに制限されており、拡張の可能性があります。