Генетический скрининг новорожденных на цистиноз и первичную гипероксалурию (GENESIS)

Предыстория и цели. Популяционный скрининг новорожденных (NBS) является важной программой общественного здравоохранения, которая значительно улучшила течение ряда заболеваний благодаря раннему выявлению. Выбор скрининговых расстройств обычно следует 10 принципам, изложенным Уилсоном и Юнгнером. В Германии NBS является добровольной программой Национальной службы здравоохранения с 1969 года, которая в настоящее время охватывает 17 заболеваний. Существующие методы NBS, которые используют тандемный масс-спектрометрический анализ высушенных пятен крови новорожденных, не могут обнаружить многие потенциально излечимые генетические состояния. В то же время NBS на молекулярной основе становится все более осуществимым, потому что ДНК можно извлечь из высушенного пятна крови, секвенирование нового поколения стало экономичным, а молекулярная диагностика становится более надежной и достоверной по мере того, как генетические базы данных становятся более совершенными и полными. Нефропатический цистиноз и гипероксалурия (ЛГ) подходят для NBS на молекулярной основе, поскольку доступны эффективные методы лечения.

В первом пилотном проекте уже можно было заложить научную основу для NBS при цистинозе. Целью данного исследования является демонстрация возможности переноса генетического NBS на цистиноз в другие лаборатории и создание научной основы для скрининга ЛГ.

В частности, в ходе исследования будет изучено, следует ли рекомендовать включение этих заболеваний в общую NBS. Путем наблюдения за выявленными младенцами в сравнении с пациентами, у которых симптомы были диагностированы за пределами пилотного проекта, будет определено, приводят ли и в какой степени ранняя диагностика и терапия к более благоприятному прогнозу.

Цистиноз Нефропатический цистиноз, обусловленный нарушением транспорта цистина из лизосом, встречается с частотой 1 случай на 100–200 000 живорождений. Он характеризуется почечным синдромом Фанкони на первом году жизни и прогрессированием гломерулярной дисфункции до терминальной стадии почечной недостаточности примерно к 10-летнему возрасту. Лечение пероральной терапией цистеамином помогает сохранить гломерулярную функцию, но больным людям в конечном итоге требуется заместительная почечная терапия Лечение цистеамином обычно начинается во время постановки диагноза на втором году жизни, но к тому времени уже произошло некоторое повреждение клубочков и канальцев. Эту ситуацию можно улучшить, диагностируя пациентов вскоре после рождения, используя скрининг новорожденных на основе молекулярной генетики. Стандартные масс-спектрометрические методы скрининга новорожденных не могут выявить повышенное содержание цистина в цистинозных лейкоцитах.

Для скрининга цистиноза первый уровень включал мультиплексную ПЦР для обнаружения двух из трех наиболее распространенных мутаций CTNS в Германии. Гетерозиготные образцы будут подвергнуты секвенированию следующего поколения на основе ампликона для выявления 175 патогенных мутаций CTNS (Labor Limbach, Mainz). При использовании этого подхода прогнозируется уровень обнаружения 96,5%.

Первичная гипероксалурия Три различных нарушения метаболизма глиоксилата приводят к ЛГ. Тяжелый тип PH1 является наиболее частым вариантом (1-3 из 106 больных). Согласно популяционным исследованиям распространенность составляет 1:58 000. По оценкам, число незарегистрированных случаев велико. Отложение кристаллов оксалата кальция в почках вызывает хроническое воспаление, которое приводит к терминальной почечной недостаточности. Снижение экскреции оксалатов с мочой приводит к повышению концентрации оксалатов в плазме и последующему отложению оксалатов кальция в органах и тканях (системный оксалез). Клиническое течение очень вариабельно. Описаны примеры инфантильного оксалоза с ранней потерей функции почек вплоть до а-/малосимптомных больных во взрослом возрасте.

Клинически PH2 протекает спокойнее, но примерно у 50% пациентов развивается терминальная стадия почечной недостаточности.

PH3 раньше считался легким вариантом, но сегодня известно, что у пациентов с PH3 также могут образовываться камни в почках в детстве и развиваться терминальная почечная недостаточность с системным оксалозом.

Регистр ЛГ OxalEurope (Европейский консорциум по гипероксалурии) в настоящее время насчитывает 1137 генетически диагностированных пациентов, в том числе 81,9% с ЛГ1, 9,8% с ЛГ2 и 8,4% с ЛГ3. В молекулярно-генетической оценке немецкого регистра результаты следующие: 74,1% PH1, 7,9% PH2 и 17% PH3.

До сих пор первичная гипероксалурия диагностировалась на основании клинических данных анализа мочи (или анализа плазмы в случае терминальной почечной недостаточности). Поэтому диагноз обычно ставится, когда у пациентов уже развилась терминальная почечная недостаточность. Но существующие лекарства (витамин В6) или новые препараты РНК-интерференции (Лумасиран, Недосиран) могут предотвратить почечную недостаточность и сделать болезнь излечимой. Целью этого пилотного проекта является выявление наиболее распространенных мутаций в гене AGXT и в гене HOGA1.

Рабочий процесс Исследуемая группа Больницы в Германии могут свободно выбирать между 11 лабораториями, сертифицированными для NBS. В этом проекте скрининг-лаборатория Ганновера информирует своих отправителей о возможности расширить стандартную NBS за счет генетического скрининга на цистиноз и ЛГ.

Исследуемая популяция включает новорожденных, чьи родители желают участвовать в пилотном проекте и дали письменное информированное согласие.

Информация и согласие родителей Перед проведением скрининга родители новорожденного всесторонне информируются о возможности обследования на различные заболевания лечащим врачом НБС (гинекологом, педиатром). Лист с дополнительной информацией и согласием на цистиноз и скрининг ЛГ вставлен в информационную брошюру, уже доступную для регулярных NBS. Согласие должно быть задокументировано подписью хотя бы одного родителя и подписью информирующего врача на форме согласия. Форма согласия на пилотный проект также включает согласие на передачу контактных данных и выводов в специализированный центр в случае аномального результата скрининга. Лаборатория должна получить форму согласия на проект до проведения анализа. Результаты, которые оказались нормальными, сообщаются ответственному врачу в соответствии с рекомендациями NBS для детей. Отправитель должен проверить наличие результата по каждой пробе крови, взятой для скрининга (контроль возврата результата).

В случае положительного результата лаборатория должна предварительно сообщить об этом отправителю и уточнить, госпитализирован ли ребенок до сих пор. В этом случае отправитель получает исходную информацию от родителей и уведомляет эксперта для постановки соответствующего диагноза (Цистиноз: Приват-Доз. Доктор мед.

К. Хоэнфельнер, Розенхайм; Гипероксалурия: проф., д.м.н. Б. Хоппе, Бонн). Если ребенок уже выписан из больницы, лаборатория напрямую свяжется с соответствующим специалистом, на которого распространяется информированное согласие.

Отбор проб Молекулярно-генетический скрининг проводится с использованием той же карты сухой капли крови, что и рутинная NBS.

В общем, для всех недействительных результатов (т. е. если контрольная реакция не удалась), а также для всех аномальных результатов (цистиноз: гомозиготный или гетерозиготный по делеции 57 т.п.н. и/или c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, гомозиготные и/или гетерозиготные) тест будет внутренне повторен для подтверждения с использованием существующего образца крови.

Измерения и методы Для четырех мутаций, описанных выше, проводят квадруплексную ПЦР в реальном времени. Цистиноз: Обнаружение проводят путем обнаружения связывания или анализа плавления флуоресцентно-меченых зондов. В образцах с положительным результатом из-за мутаций гетерозиготности экзоны гена цистинозина (CTNS) секвенируют с помощью секвенирования следующего поколения (NBS) методом на основе ампликона. Это гарантирует, что исследуются только нужные экзоны и никакие другие участки ДНК. ДНК, уже выделенная для мультиплексной ПЦР в реальном времени, может быть использована для NBS. Решение для прямого генотипирования NEBNext покрывает все анализируемые области гена CTNS (частичное перекрытие), что сохраняет полную информацию о последовательности всех экзонов и конкретных интронов. Следовательно, ДНК будет ферментативно фрагментирована, а затем лигирована с помощью светящихся адаптеров. Адаптеры содержат индивидуальные индексы. После этого биотиновые шарики будут использоваться для целевого обогащения. Они будут дополнены шариками стрептавидина. После этого нецелевые последовательности будут удалены, а библиотеки будут амплифицированы с помощью ПЦР. Фактическое секвенирование осуществляется с помощью устройства Illumina (MiniSeq). Последовательности оцениваются с помощью программного обеспечения, которое выполняет автоматическое сравнение с эталонной последовательностью, тем самым обнаруживая мутации.

PH: Обнаружение будет осуществляться с помощью анализа охоты с флуоресцентными метками. В случае положительных результатов (в том числе из-за гетерозиготных констелляций) планируется уточнение в сотрудничестве с немецким центром гипероксалурии. Таким образом, моча будет проверена на наличие оксалата и другие параметры метаболизма глиоксилата.

Результаты обследования Цистиноз: При выявлении наиболее частых мутаций CTNS в виде гомозиготных или составных гетерозиготных мутаций скрининг на цистиноз считается положительным. С помощью секвенирования следующего поколения будут обнаружены еще 175 мутаций, зарегистрированных в литературе. Во всех остальных случаях, даже при гетерозиготном статусе, скрининг на цистиноз является нормальным.

PH: Скрининг на гипероксалурию положительный, если обнаружена гомозигота PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) и/или PH3 (HOGA-ген: c.700+5G>T). При гетерозиготном генетическом носителе с положительным скринингом последующий анализ мочи, проведенный в лаборатории Wisplinghoff в Кельне (Кельн), прояснит результат.

Уровень выявления, ложноположительные и ложноотрицательные результаты Предполагается, что общий уровень выявления выше 95% для обоих заболеваний. Ложноотрицательные результаты скрининга маловероятны.

Для цистиноза возможны ложноотрицательные результаты из-за ранее неизвестных редких мутаций или у пациентов, не несущих ни одну из двух наиболее частых мутаций.

Ложноположительные результаты скрининга также очень маловероятны. При цистинозе гетерозиготный образец из-за «выпадения аллеля» (сбой ПЦР аллеля из-за мутаций в области связывания праймера) может ошибочно выглядеть гомозиготным.

При ЛГ заболевание не исключено в случае гетерозиготной мутации, необходима и запланирована дальнейшая диагностика.

При наличии соответствующих симптомов цистиноз или ЛГ необходимо включить в дифференциальный диагноз, который обычно проводится в одном из немногих лечебных центров. Такие случаи могут быть задокументированы только с течением времени посредством обратной связи центров обслуживания.

Подтверждение диагноза Цистиноз: у пациентов с гомозиготной или сложной гетерозиготной мутацией в гене CTNS диагноз будет подтвержден определением внутрилейкоцитарного уровня цистина в 2,3 мл крови с ЭДТА. Этот образец будет отправлен в метаболическую лабораторию в Гейдельберге в течение первых 14 дней жизни.

PH: У гомозиготных носителей мутаций в генах PH1 или PH3 последует контрольное исследование мочи или плазмы, которое будет проведено в Немецком центре гипероксалурии.

Результаты проверочных испытаний будут переданы в скрининговую лабораторию для контроля качества.

Уход за больными детьми Цистиноз: Детей с положительными результатами скрининга на цистиноз и их родителей направляют в ближайший центр метаболических заболеваний. Терапию цистеамином можно начинать сразу после подтверждения диагноза. Родители проинформированы о возможности междисциплинарной консультации по цистинозу в Розенхайме.

PH: Детей с положительным результатом скрининга в первую очередь направляют в немецкий центр гипероксалурии в Бонне.

Дальнейшее лечение этих больных проводится в ближайшей больнице по их выбору.

Размер проекта По финансовым причинам проект ограничен 200 000 образцов с возможностью расширения.