시스틴증 및 원발성 고산소뇨증에 대한 신생아 유전 선별검사 (GENESIS)

배경 및 목표. 인구 기반 신생아 선별검사(NBS)는 조기 발견을 통해 여러 질병의 경과를 크게 개선한 중요한 공중 보건 프로그램입니다. 선별된 장애의 선택은 일반적으로 Wilson과 Jungner가 약술한 10가지 원칙을 따릅니다. 독일에서 NBS는 1969년부터 현재 17개 장애를 다루는 자발적인 국민 건강 서비스 프로그램입니다. 신생아 건조 혈반에 대한 직렬 질량 분광 분석을 사용하는 현재 NBS 방법은 잠재적으로 치료 가능한 많은 유전적 상태를 감지할 수 없습니다. 동시에 건조된 혈반에서 DNA를 추출할 수 있고, 차세대 시퀀싱이 경제적이며, 유전자 데이터베이스가 보다 정교하고 포괄적이면서 분자 진단의 신뢰성과 타당성이 높아짐에 따라 분자 기반 NBS의 실현 가능성이 높아지고 있습니다. 신병성 시스틴증 및 과수소뇨증(PH)은 효과적인 치료법이 있기 때문에 분자 기반 NBS에 적합합니다.

첫 번째 파일럿 프로젝트에서 시스틴증에 대한 NBS의 과학적 근거가 이미 확립될 수 있었습니다. 이 연구의 목적은 시스틴증에 대한 유전적 NBS의 다른 실험실로의 전이 가능성을 입증하고 PH 선별을 위한 과학적 근거를 마련하는 것입니다.

구체적으로, 이 연구는 이러한 질병을 일반 NBS에 포함하는 것이 권장되어야 하는지 여부를 조사할 것입니다. 파일럿 프로젝트 외부에서 증상 진단을 받은 환자와 비교하여 식별된 영아를 관찰함으로써 조기 진단 및 치료가 더 유리한 예후로 이어지는지 여부와 어느 정도까지 결정됩니다.

시스틴증 신병성 시스틴증은 리소좀에서 시스틴의 수송 장애로 인해 발생하며 100-200,000건의 정상 출생 중 1건의 빈도로 발생합니다. 생후 1년에 신 판코니 증후군이 발생하고 약 10세까지 사구체 기능 장애가 말기 신장 질환으로 진행되는 것이 특징입니다. 경구용 시스테아민 요법으로 치료하면 사구체 기능을 보존하는 데 도움이 되지만 영향을 받은 개체는 결국 신장 대체 요법이 필요합니다. 이러한 상황은 분자 유전학 기반 신생아 선별 검사를 사용하여 출생 직후 환자를 진단함으로써 개선될 수 있습니다. 신생아 선별검사를 위한 표준 질량분석법 기반 방법은 시스틴증 백혈구의 증가된 시스틴 함량을 감지할 수 없습니다.

시스틴증 스크리닝의 경우, 첫 번째 단계는 독일에서 가장 흔한 세 가지 CTNS 돌연변이 중 두 가지를 검출하기 위해 다중 PCR을 포함했습니다. 이형 접합체 샘플은 175개의 병원성 CTNS 돌연변이(Labor Limbach, Mainz)에 대한 amplicon 기반 차세대 시퀀싱에 제출됩니다. 이 접근법을 사용하여 96.5%의 탐지율이 예측됩니다.

원발성 고옥살루리아 글리옥실레이트 대사의 세 가지 기본값이 PH를 유발합니다. 중증 유형 PH1이 가장 흔한 변이형입니다(106명의 환자 중 1-3명). 인구 기반 연구에서는 유병률을 1:58,000으로 추정합니다. 보고되지 않은 추정 사례 수가 많습니다. 신장에 칼슘 옥살레이트 결정이 침착되면 말기 신부전을 초래하는 만성 염증이 유발됩니다. 소변에서 감소된 옥살레이트 배설은 혈장 내 높은 옥살레이트 농도를 초래하고 이어서 장기 및 조직에 칼슘 옥살레이트 침착(전신성 옥살증)을 초래합니다. 임상 경과는 매우 다양합니다. 성인기에 a-/oligosymptomatic 환자까지 초기 신장 기능 손실이 있는 영아 옥살증의 예가 설명되어 있습니다.

임상적으로 PH2는 더 조용하지만 약 50%의 환자에서 말기 신부전이 발생합니다.

PH3는 가벼운 변이로 간주되었지만 오늘날 PH3 환자는 어린 시절에 신장 결석이 발생하고 전신 옥살증을 동반한 말기 신부전이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있습니다.

OxalEurope(European hyperoxaluria consortium)의 PH 등록에는 현재 PH1이 81.9%, PH2가 9.8%, PH3가 8.4%로 구성된 1,137명의 유전적으로 진단된 환자가 나열되어 있습니다. 독일 레지스트리의 분자 유전적 평가에서 결과는 74.1% PH1, 7.9% PH2 및 17% PH3입니다.

지금까지 원발성 고옥산뇨증은 요검사(또는 말기신부전의 경우 혈장검사)를 통한 임상소견에 따라 진단되었다. 따라서 진단은 일반적으로 환자가 이미 말기 신부전이 발생한 후에 이루어집니다. 그러나 기존 약물(비타민 B6) 또는 새로운 RNAi 약물(Lumasiran, Nedosiran)은 신부전을 예방할 수 있으며 질병을 치료할 수 있게 만들고 있습니다. 이 파일럿 프로젝트의 목적은 AGXT 유전자와 HOGA1 유전자에서 가장 흔한 돌연변이를 식별하는 것입니다.

워크플로 연구 모집단 독일의 병원은 NBS에 대해 11개의 인증된 실험실 중에서 자유롭게 선택할 수 있습니다. 이 프로젝트에서 Screening-Laboratory Hannover는 발신자에게 시스틴증 및 PH에 대한 유전자 스크리닝을 통해 일상적으로 확립된 NBS를 확장할 수 있는 가능성에 대해 알립니다.

연구 인구에는 부모가 파일럿 프로젝트에 참여하기를 원하고 서면 동의서를 제공한 신생아가 포함됩니다.

부모 정보 및 동의 선별검사를 시행하기 전에 신생아의 부모에게 NBS를 담당하는 의사(산부인과 전문의, 소아과 의사)로부터 각종 질병에 대한 선별검사 가능성에 대해 종합적으로 안내합니다. 시스틴증 및 PH 선별검사에 대한 추가 정보 및 동의서는 일반 NBS에서 이미 제공되는 정보 책자에 삽입되어 있습니다. 동의서는 적어도 한 명의 부모의 서명과 동의서에 알리는 의사의 서명과 함께 문서화되어야 합니다. 시범사업 동의서에는 선별검사 결과 이상 시 연락처 및 소견을 전문센터로 이전하는 것에 대한 동의도 포함되어 있다. 실험실은 분석 전에 프로젝트에 대한 동의서를 받아야 합니다. 정상으로 판명된 결과는 어린이를 위한 NBS 가이드라인에 따라 담당 제출 의사에게 보고됩니다. 발송인은 스크리닝을 위해 채혈한 각 혈액 샘플에 대해 결과가 있는지 확인해야 합니다(결과 회신 제어).

양성 결과의 경우 검사실은 먼저 보낸 사람에게 알리고 아동이 아직 입원 중인지 확인해야 합니다. 이 경우 발신인은 부모로부터 초기 정보를 얻어 각각의 진단에 대해 전문가에게 알립니다(Cystinosis: Priv.-Doz. 닥터메드

K. Hohenfellner, 로젠하임; Hyperoxaluria: Prof. Dr. med. B. 호페, 본). 아동이 이미 병원에서 퇴원한 경우 검사실은 정보에 입각한 동의서가 적용되는 관련 전문가에게 직접 연락합니다.

샘플링 분자 유전자 스크리닝은 일상적인 NBS와 동일한 건조 혈흔 카드를 사용하여 수행됩니다.

일반적으로 모든 유효하지 않은 결과(즉, 대조 반응이 실패한 경우) 및 모든 비정상 결과(시스틴증: 57-kb 결실에 대한 동형접합 또는 이형접합 및/또는 c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, 동형접합 및/또는 이형접합) 테스트는 기존 혈액 샘플을 사용하여 확인을 위해 내부적으로 반복됩니다.

측정 및 방법 실시간 사중체 PCR은 위에서 설명한 네 가지 돌연변이에 대해 수행됩니다. 시스틴증: 검출은 결합 검출 또는 형광 표지 프로브의 용융 분석에 의해 수행됩니다. heterozygosity 돌연변이로 인해 양성 결과가 나온 샘플에서 시스티노신 유전자(CTNS)의 엑손은 amplicon 기반 방법에서 NBS(next generation sequencing)를 사용하여 시퀀싱됩니다. 이렇게 하면 원하는 엑손만 검사되고 다른 DNA 영역은 검사되지 않습니다. Real-time multiplex PCR을 위해 이미 추출된 DNA는 NBS에 사용할 수 있습니다. NEBNext Direct Genotyping Solution을 사용하면 CTNS 유전자의 모든 분석 가능한 영역을 커버(부분 중첩)하여 모든 엑손 및 특정 인트론의 완전한 서열 정보를 보존합니다. 따라서 DNA는 효소로 조각난 다음 조명 어댑터로 결찰됩니다. 어댑터에는 개별 인덱스가 포함되어 있습니다. 그 후 비오틴 비드는 표적 농축에 사용됩니다. 그들은 streptavidin 구슬로 보강됩니다. 그 후 비표적 서열이 제거되고 라이브러리가 PCR로 증폭됩니다. 실제 시퀀싱은 Illumina(MiniSeq)의 장치를 사용하여 수행됩니다. 참조 서열과 자동 비교를 수행하여 돌연변이를 검출하는 소프트웨어를 사용하여 서열을 평가합니다.

PH: 형광 태그가 있는 리드를 사용한 열 분석을 통해 감지가 수행됩니다. 양성 결과의 경우(또한 이형접합 별자리로 인해) 독일 과수소뇨증 센터와 협력하여 설명이 계획됩니다. 따라서, 점뇨는 옥살레이트 및 글리옥실레이트 대사의 추가 매개변수에 대해 테스트됩니다.

검사 결과 시스틴증: CTNS의 가장 빈번한 돌연변이가 동형접합 또는 복합 이형접합 돌연변이로 검출되면 시스틴증 선별검사에서 양성으로 간주됩니다. 차세대 시퀀싱을 사용하여 문헌에 기록된 추가 175개의 돌연변이를 검출합니다. 다른 모든 경우에는 이형 접합 상태를 포함하는 경우에도 시스틴증 선별검사는 정상입니다.

PH: PH1(AGXT-Gen:c508G>A) 및/또는 PH3(HOGA-gene: c.700+5G>T)이 동형접합체로 검출되면 고옥살루리아 스크리닝이 양성입니다. 선별 검사가 양성인 이형 접합체 유전 보인자에서 Cologne(Köln)의 Wisplinghoff 실험실에서 수행된 후속 소변 검사는 결과를 명확히 할 것입니다.

검출률, 위양성 및 위음성 결과 두 질병 모두 전체 검출률이 95% 이상이라고 가정합니다. 위음성 선별 결과는 거의 없습니다.

시스틴증의 경우, 이전에 알려지지 않은 희귀 돌연변이로 인한 위음성 결과 또는 가장 빈번한 두 돌연변이 중 어느 것도 가지고 있지 않은 환자가 가능합니다.

위양성 선별 결과도 가능성이 매우 낮습니다. 시스틴증의 경우 "대립유전자 탈락"(프라이머 결합 영역의 돌연변이로 인한 대립유전자의 PCR 실패)으로 인한 이형접합 샘플이 동형접합으로 잘못 나타날 수 있습니다.

PH에서 이형 접합 돌연변이의 경우 질병이 배제되지 않으며 추가 진단이 필요하고 계획됩니다.

해당 증상이 있는 경우 시스틴증이나 PH를 감별진단에 포함시켜야 하며, 일반적으로 소수의 치료센터 중 한 곳에서 이루어집니다. 이러한 사례는 참석 센터의 피드백을 통해 시간이 지남에 따라 문서화될 수 있습니다.

시스틴증 진단 확인: CTNS 유전자에 동형접합 또는 복합 이형접합 돌연변이가 있는 환자의 경우 2,3 ml EDTA 혈액에서 백혈구내 시스틴 수준을 측정하여 진단을 확인할 수 있습니다. 이 샘플은 생후 14일 이내에 하이델베르크의 대사 실험실로 보내집니다.

PH: PH1 또는 PH3 유전자 돌연변이의 동형접합 보인자에서 단석뇨 또는 혈장에 대한 통제 검사가 뒤따를 것이며, 이는 독일 고산소뇨증 센터에서 수행될 것입니다.

검증 테스트 결과는 품질 관리를 위해 선별 검사실로 이관됩니다.

영향을 받은 어린이 돌보기 시스틴증: 시스틴증 검사 결과 양성인 어린이와 그 부모는 가장 가까운 대사 질환 센터로 의뢰됩니다. 시스테아민 치료는 진단 확인 후 즉시 시작할 수 있습니다. 부모는 Rosenheim에서 학제간 시스틴증 상담 가능성에 대해 알립니다.

PH: 선별 검사 결과가 양성인 아동은 주로 본에 있는 독일 과수소뇨증 센터로 보내집니다.

이 환자들의 추가 치료는 그들이 선택한 가장 가까운 병원에서 수행됩니다.

프로젝트 규모 재정상의 이유로 프로젝트는 확장 가능성이 있는 200,000개의 샘플로 제한됩니다.