Genetisk nyfødtscreening for cystinose og primær hyperoxaluri (GENESIS)

Baggrund og mål. Populationsbaseret screening af nyfødte (NBS) er et vigtigt folkesundhedsprogram, som har forbedret forløbet af adskillige sygdomme betydeligt gennem tidlig påvisning. Udvælgelsen af ​​screenede lidelser følger generelt de 10 principper, der er skitseret af Wilson og Jungner. I Tyskland har NBS været et frivilligt National Health Service-program siden 1969, som i øjeblikket dækker 17 lidelser. Nuværende NBS-metoder, som anvender tandem massespektrometrisk analyse af nyfødte tørrede blodpletter, kan ikke påvise mange potentielt behandlelige genetiske tilstande. Samtidig er molekylær-baseret NBS i stigende grad gennemførlig, fordi DNA kan udvindes fra en tørret blodplet, næste generations sekventering er blevet økonomisk, og molekylær diagnostik har større pålidelighed og øget validitet, efterhånden som genetiske databaser bliver mere raffinerede og omfattende. Nefropatisk cystinose og hyperoxaluri (PH) er berettiget til molekylær-baseret NBS, fordi effektive terapier er tilgængelige.

I et første pilotprojekt kunne det videnskabelige grundlag for NBS for cystinose allerede etableres. Formålet med denne undersøgelse er at demonstrere overførbarheden af ​​genetisk NBS for cystinose til andre laboratorier og at lægge det videnskabelige grundlag for screening for PH.

Konkret vil undersøgelsen undersøge, om inddragelse af disse sygdomme i generel NBS bør anbefales. Ved at observere de identificerede spædbørn i forhold til patienter, der er symptomatisk diagnosticeret uden for pilotprojektet, vil det blive fastslået, om og i hvilket omfang tidlig diagnose og terapi fører til en mere gunstig prognose.

Cystinose Nefropatisk cystinose, på grund af nedsat transport af cystin ud af lysosomer, forekommer med en forekomst på 1 ud af 100-200.000 levendefødte. Det er karakteriseret ved renalt Fanconi-syndrom i det første leveår og glomerulær dysfunktion progression til slutstadiet af nyresygdom ved ca. 10 års alderen. Behandling med oral cysteaminterapi hjælper med at bevare den glomerulære funktion, men berørte personer kræver i sidste ende nyreudskiftningsterapi Cysteaminbehandling begynder generelt på diagnosetidspunktet i det andet leveår, men der er allerede opstået nogle glomerulære og tubulære skader på det tidspunkt. Denne situation kunne afhjælpes ved at diagnosticere patienter kort efter fødslen ved at anvende molekylærgenetik-baseret nyfødtscreening. Standard massespektrometri-baserede metoder til screening af nyfødte kan ikke påvise det øgede cystinindhold i cystinose leukocytter.

Til cystinosescreening involverede det første niveau multipleks PCR for at påvise to af de tre mest almindelige CTNS-mutationer i Tyskland. Heterozygote prøver vil blive underkastet amplikon-baseret næste generations sekventering for 175 patogene CTNS-mutationer (Labor Limbach, Mainz). En detektionsrate på 96,5 % forudsiges ved hjælp af denne fremgangsmåde.

Primær hyperoxaluri Tre forskellige defaults i glyoxylatmetabolismen fører til PH. Den svære type PH1 er den mest almindelige variant (1-3 ud af 106 patienter). Populationsbaserede undersøgelser anslår en prævalens på 1:58.000. Det estimerede antal uanmeldte tilfælde er højt. Aflejringen af ​​calciumoxalatkrystaller i nyrerne udløser en kronisk betændelse, som resulterer i terminal nyresvigt. Nedsat oxalatudskillelse i urinen fører til høje oxalatkoncentrationer i plasma og efterfølgende aflejringer af calciumoxalat i organer og væv (systemisk oxalose). Det kliniske forløb er meget varierende. Eksempler på infantil oxalose med tidligt nedsat nyrefunktion op til a-/oligosymptomatiske patienter i voksenalderen er beskrevet.

Klinisk er PH2 mere rolig, men omkring 50 % af patienterne udvikler nyresvigt i slutstadiet.

PH3 blev tidligere betragtet som en mild variant, men man ved i dag, at PH3-patienter også kan udvikle nyresten i barndommen og udvikle terminalt nyresvigt med en systemisk oxalose.

PH-registret for OxalEurope (European hyperoxaluria consortium) lister i øjeblikket 1137 genetisk diagnosticerede patienter, bestående af 81,9% med PH1, 9,8% med PH2 og 8,4% med PH3. I den molekylærgenetiske evaluering af det tyske register er resultaterne: 74,1% PH1, 7,9% PH2 og 17% PH3.

Hidtil er primær hyperoxaluri blevet diagnosticeret i henhold til kliniske fund gennem urinanalyse (eller plasmatest i tilfælde af terminal nyresvigt). Derfor stilles diagnosen normalt, når patienterne allerede har udviklet terminal nyresvigt. Men eksisterende medicin (Vitamin B6) eller den nye RNAi-medicin (Lumasiran, Nedosiran) kan forhindre nyresvigt og gør sygdommen behandlelig. Formålet med dette pilotprojekt er at identificere de mest almindelige mutationer i AGXT-genet og i HOGA1-genet.

Workflow-undersøgelsespopulation Hospitaler i Tyskland kan frit vælge mellem 11 certificerede laboratorier for NBS. I dette projekt informerer Screening-Laboratory Hannover sine afsendere om muligheden for at udvide den rutinemæssigt etablerede NBS med den genetiske screening for cystinose og PH.

Undersøgelsespopulationen omfatter nyfødte, hvis forældre ønsker at deltage i pilotprojektet og har givet skriftligt informeret samtykke.

Forældreinformation og samtykke Inden screening foretages, informeres den nyfødtes forældre udførligt om muligheden for screening for de forskellige sygdomme af den NBS-ansvarlige læge (gynækolog, børnelæge). Et yderligere informations- og samtykkeark for cystinose og PH-screening er indsat i den informationsbrochure, der allerede er tilgængelig for almindelig NBS. Samtykke skal dokumenteres med mindst én forælders underskrift og underskrift af den informerende læge på samtykkeerklæringen. Samtykkeskemaet til pilotprojektet indeholder også samtykke til overførsel af kontaktdata og fund til et specialiseret center ved unormalt screeningsresultat. Laboratoriet skal modtage samtykkeerklæringen til projektet forud for analyse. Resultater, der viser sig normale, indberettes til den ansvarlige indsendende læge i henhold til NBS retningslinjer for børn. Afsender skal kontrollere, om der er resultat for hver blodprøve, der tages til screening (resultatreturkontrol).

Ved positivt resultat skal laboratoriet først informere afsender og afklare, om barnet stadig er indlagt. I så fald indhenter afsenderen de første oplysninger fra forældrene og underretter en ekspert om den respektive diagnose (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hyperoxaluri: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Hvis barnet allerede er udskrevet fra hospitalet, vil laboratoriet kontakte den relevante ekspert direkte, som er omfattet af det informerede samtykke.

Prøveudtagning Den molekylærgenetiske screening udføres ved hjælp af det samme tørrede blodpletkort som den rutinemæssige NBS.

Generelt for alle ugyldige resultater (dvs. hvis kontrolreaktionen mislykkes) såvel som alle unormale resultater (cystinose: homozygot eller heterozygot for 57-kb deletionen og/eller c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozygot og/eller heterozygot) vil testen blive gentaget internt til bekræftelse ved brug af den eksisterende blodprøve.

Målinger og metoder En real-time quadruplex PCR udføres for de fire mutationer beskrevet ovenfor. Cystinose: Påvisning udføres ved påvisning af bindingen eller ved smelteanalyse af fluorescensmærkede prober. I prøver med et positivt resultat på grund af heterozygositetsmutationer sekventeres exonerne af cystinosingenet (CTNS) ved hjælp af næste generations sekventering (NBS) i en amplikon-baseret metode. Dette sikrer, at kun de ønskede exoner og ingen andre DNA-områder undersøges. DNA, der allerede er ekstraheret til multiplex-PCR i realtid, kan bruges til NBS. Med NEBNext Direct Genotyping Solution er alle analyserbare områder af CTNS-genet dækket (delvis overlappende), hvilket bevarer en fuldstændig sekvensinformation af alle exoner og specifikke introner. Derfor vil DNA'et blive enzymatisk fragmenteret og derefter ligeret med lysbare adaptorer. Adapterne indeholder individuelle indekser. Bagefter vil biotinperlerne blive brugt til målberigelsen. De vil blive forstærket med streptavidin perler. Bagefter vil sekvenser uden for mål blive fjernet, og bibliotekerne vil blive amplificeret ved PCR. Selve sekventeringen udføres ved hjælp af en enhed fra Illumina (MiniSeq). Sekvenserne evalueres ved hjælp af en software, der udfører en automatisk sammenligning med en referencesekvens, hvorved mutationer detekteres.

PH: Detektionen vil ske gennem varmeanalyse med fluorescerende mærkede ledninger. Ved positive resultater (også på grund af heterozygotiske konstellationer) planlægges en afklaring i samarbejde med det tyske hyperoxaluricenter. Derfor vil pleturin blive testet for oxalat og yderligere parametre i glyoxylatmetabolismen.

Undersøgelsesresultater Cystinose: Hvis de hyppigste mutationer af CTNS påvises som homozygote eller sammensatte heterozygote mutationer, anses cystinosescreeningen for positiv. Ved hjælp af næste generations sekventering vil yderligere 175 mutationer registreret i litteraturen blive påvist. I alle andre tilfælde, selv dem, der involverer heterozygot status, er cystinosescreening normal.

PH: Hyperoxaluri-screeningen er positiv, hvis PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) og/eller PH3 (HOGA-gen: c.700+5G>T) er homozygot påvist. Hos heterozygot genetisk bærer med positiv screening vil en efterfølgende urintest udført i Wisplinghoff-laboratoriet i Köln (Køln) afklare fundet.

Detektionsrate, falsk positive og falsk negative resultater En samlet detektionsrate på over 95 % antages for begge sygdomme. Falske negative screeningsresultater er usandsynlige.

For cystinose er falsk negative resultater på grund af hidtil ukendte sjældne mutationer eller patienter, der ikke bærer nogen af ​​de to hyppigste mutationer, mulige.

Falske positive screeningsresultater er også meget usandsynlige. Ved cystinose kan en heterozygot prøve på grund af "allel frafald" (PCR-svigt af en allel på grund af mutationer i primerbindingsregionen) ukorrekt fremstå som homozygot.

Ved PH er sygdommen ikke udelukket i tilfælde af heterozygot mutation, yderligere diagnostik er nødvendig og planlagt.

Ved tilsvarende symptomer skal cystinose eller PH indgå i differentialdiagnosen, som normalt foregår på et af de få behandlingssteder. Sådanne sager kan kun dokumenteres i tidens løb via tilbagemeldinger fra behandlingscentrene kan dokumenteres.

Bekræftelse af diagnosen Cystinose: Hos patienter med enten en homozygot eller sammensat heterozygot mutation i CTNS-genet vil diagnosen blive bekræftet ved at bestemme det intraleukocytiske cystinniveau ud fra 2,3 ml EDTA-blod. Denne prøve vil blive sendt til det metaboliske laboratorium i Heidelberg inden for de første 14 dage af livet.

PH: Hos homozygote bærere af mutationerne i PH1- eller PH3-generne følger en kontrolundersøgelse af pleturin eller af plasma, som vil blive foretaget i det tyske hyperoxaluricenter.

Resultaterne af verifikationstestene vil blive overført til screeningslaboratoriet for kvalitetskontrol.

Omsorg for berørte børn Cystinose: Børn med positive cystinosescreeningsresultater og deres forældre henvises til det nærmeste center for stofskiftesygdomme. Behandling med cysteamin kan startes umiddelbart efter bekræftelse af diagnosen. Forældre orienteres om muligheden for en tværfaglig cystinosekonsultation i Rosenheim.

PH: Børn med et positivt screeningsresultat vil primært blive henvist til det tyske hyperoxaluricenter i Bonn.

Yderligere behandling af disse patienter udføres på det nærmeste sygehus efter eget valg.

Projektstørrelse Af økonomiske årsager er projektet begrænset til 200.000 stikprøver med mulighed for udvidelse.