Geneettinen vastasyntyneen seulonta kystinoosin ja primaarisen hyperoksalurian varalta (GENESIS)

Tausta ja tavoitteet. Väestöpohjainen vastasyntyneiden seulonta (NBS) on tärkeä kansanterveysohjelma, joka on parantanut huomattavasti useiden sairauksien etenemistä varhaisen havaitsemisen ansiosta. Seulottujen häiriöiden valinta noudattaa yleensä Wilsonin ja Jungnerin hahmottelemia 10 periaatetta. Saksassa NBS on ollut vapaaehtoinen National Health Service -ohjelma vuodesta 1969, joka kattaa tällä hetkellä 17 sairautta. Nykyiset NBS-menetelmät, joissa käytetään vastasyntyneiden kuivuneiden veripisteiden tandemmassaspektrometristä analyysiä, eivät pysty havaitsemaan monia mahdollisesti hoidettavissa olevia geneettisiä tiloja. Samaan aikaan molekyylipohjainen NBS on yhä käyttökelpoisempi, koska DNA:ta voidaan erottaa kuivatusta veripisteestä, seuraavan sukupolven sekvensointi on tullut taloudellisemmaksi ja molekyylidiagnostiikan luotettavuus ja validiteetti lisääntyvät geneettisten tietokantojen tarkentuessa ja kattavammin. Nefropaattinen kystinoosi ja hyperoksaluria (PH) ovat kelvollisia molekyylipohjaiseen NBS:ään, koska tehokkaita hoitoja on saatavilla.

Ensimmäisessä pilottihankkeessa kystinoosin NBS:n tieteellinen perusta voitiin jo luoda. Tämän tutkimuksen tavoitteena on osoittaa kystinoosin geneettisen NBS:n siirrettävyys muihin laboratorioihin ja luoda tieteellinen perusta PH-seulonnalle.

Erityisesti tutkimuksessa selvitetään, pitäisikö näiden sairauksien sisällyttämistä yleiseen NBS:ään suositella. Tarkkailemalla tunnistettuja vauvoja verrattuna pilottiprojektin ulkopuolella oireellisesti diagnosoituihin potilaisiin selvitetään, johtaako varhainen diagnoosi ja hoito suotuisampaan ennusteeseen ja missä määrin.

Kystinoosi Nefropaattista kystinoosia, joka johtuu kystiinin heikentyneestä kuljetuksesta lysosomeista, esiintyy yhdellä 100-200 000 elävänä syntyneestä. Sille on ominaista munuais-Fanconin oireyhtymä ensimmäisenä elinvuotena ja munuaiskerästen toimintahäiriö, joka etenee loppuvaiheen munuaissairaudeksi noin 10 vuoden iässä. Suun kautta otettava kysteamiinihoito auttaa säilyttämään munuaiskerästen toiminnan, mutta sairaat tarvitsevat lopulta munuaiskorvaushoitoa. Kysteamiinihoito aloitetaan yleensä diagnoosin yhteydessä toisena elinvuotena, mutta silloin on jo tapahtunut glomerulus- ja tubulusvaurioita. Tätä tilannetta voitaisiin parantaa diagnosoimalla potilaat pian syntymän jälkeen käyttämällä molekyyligenetiikkaan perustuvaa vastasyntyneiden seulontaa. Vakiomassaspektrometriaan perustuvat vastasyntyneiden seulonnan menetelmät eivät pysty havaitsemaan kystinoosileukosyyttien lisääntynyttä kystiinipitoisuutta.

Kystinoosiseulontaa varten ensimmäinen taso sisälsi multipleksisen PCR:n kahden Saksan kolmesta yleisimmästä CTNS-mutaatiosta havaitsemiseksi. Heterotsygoottisille näytteille suoritetaan amplikonipohjainen seuraavan sukupolven sekvensointi 175 patogeenisen CTNS-mutaation varalta (Labor Limbach, Mainz). Tällä lähestymistavalla ennustetaan havaitsemisasteeksi 96,5 %.

Primaarinen hyperoksaluria Glyoksylaattiaineenvaihdunnassa kolme erilaista oletusarvoa johtavat PH:hon. Vaikea tyyppi PH1 on yleisin variantti (1-3 potilasta 106:sta). Väestöpohjaisten tutkimusten mukaan esiintyvyys on 1:58 000. Ilmoittamattomien tapausten arvioitu määrä on suuri. Kalsiumoksalaattikiteiden kerääntyminen munuaisiin laukaisee kroonisen tulehduksen, joka johtaa terminaaliseen munuaisten vajaatoimintaan. Vähentynyt oksalaattieritys virtsaan johtaa korkeisiin oksalaattipitoisuuksiin plasmassa ja sen seurauksena kalsiumoksalaattikertymiin elimiin ja kudoksiin (systeeminen oksaloosi). Kliininen kulku on erittäin vaihteleva. Kuvataan esimerkkejä infantiilista oksaloosista, johon liittyy varhainen munuaisten toiminnan heikkeneminen a-/oligosymptomaattisille potilaille aikuisiässä.

Kliinisesti PH2 on rauhallisempi, mutta noin 50 %:lle potilaista kehittyy loppuvaiheen munuaisten vajaatoiminta.

PH3:a pidettiin aiemmin lievänä muunnelmana, mutta nykyään tiedetään, että PH3-potilaille voi kehittyä myös lapsuudessa munuaiskiviä ja kehittyä terminaalinen munuaisten vajaatoiminta, johon liittyy systeeminen oksaloosi.

OxalEuropen (European hyperoxaluria consortium) PH-rekisterissä on tällä hetkellä 1137 geneettisesti diagnosoitua potilasta, joista 81,9 % on PH1, 9,8 % PH2 ja 8,4 % PH3. Saksalaisen rekisterin molekyyligeneettisessä arvioinnissa tulokset ovat: 74,1 % PH1, 7,9 % PH2 ja 17 % PH3.

Tähän mennessä primaarinen hyperoksaluria on diagnosoitu kliinisten löydösten perusteella virtsaanalyysin (tai terminaalisen munuaisten vajaatoiminnan tapauksessa plasmatestin) perusteella. Siksi diagnoosi tehdään yleensä, kun potilailla on jo kehittynyt terminaalinen munuaisten vajaatoiminta. Mutta olemassa olevat lääkkeet (B6-vitamiini) tai uudet RNAi-lääkkeet (Lumasiran, Nedosiran) voivat estää munuaisten vajaatoimintaa ja tekevät taudista hoidettavan. Tämän pilottiprojektin tarkoituksena on tunnistaa yleisimmät mutaatiot AGXT-geenissä ja HOGA1-geenissä.

Työnkulku Tutkimuspopulaatio Saksan sairaalat voivat vapaasti valita 11 NBS:n sertifioidun laboratorion välillä. Hannoverin seulontalaboratorio tiedottaa tässä projektissa lähettäjilleen mahdollisuudesta laajentaa rutiininomaisesti muodostunutta NBS:ää geneettisellä kystinoosin ja PH:n seulonnalla.

Tutkimuspopulaatioon kuuluvat vastasyntyneet, joiden vanhemmat haluavat osallistua pilottihankkeeseen ja ovat antaneet kirjallisen tietoisen suostumuksen.

Vanhemman tiedot ja suostumus Ennen seulonnan suorittamista vastasyntyneen vanhemmille tiedotetaan NBS:stä vastaavan lääkärin (gynekologi, lastenlääkäri) kattavasti mahdollisuudesta seuloa eri sairauksia. Lisätieto- ja suostumuslomake kystinoosista ja PH-seulonnasta on lisätty tavalliselle NBS:lle jo saatavilla olevaan esitteeseen. Suostumus tulee dokumentoida vähintään yhden vanhemman allekirjoituksella ja suostumuslomakkeella ilmoittavan lääkärin allekirjoituksella. Pilottihankkeen suostumuslomake sisältää myös suostumuksen yhteystietojen ja löydösten siirtämiseen erikoiskeskukseen, jos seulontatulos on poikkeava. Laboratorion tulee saada hankkeen suostumuslomake ennen analyysiä. Normaalit tulokset ilmoitetaan asiasta vastaavalle lääkärille NBS:n lapsille annettujen ohjeiden mukaisesti. Lähettäjän tulee tarkistaa, onko jokaisesta seulontaan otetusta verinäytteestä tulos (tuloksen palautuskontrolli).

Jos tulos on positiivinen, laboratorion on ensin ilmoitettava lähettäjälle ja selvitettävä, onko lapsi edelleen sairaalahoidossa. Siinä tapauksessa lähettäjä saa alustavat tiedot vanhemmilta ja ilmoittaa asiantuntijalle vastaavasta diagnoosista (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hyperoksaluria: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Jos lapsi on jo kotiutettu sairaalasta, laboratorio ottaa suoraan yhteyttä asianomaiseen asiantuntijaan, jota tietoinen suostumus koskee.

Näytteenotto Molekyyligeneettinen seulonta suoritetaan käyttämällä samaa kuivattua veripistekorttia kuin rutiini-NBS.

Yleensä kaikille virheellisille tuloksille (eli jos kontrollireaktio epäonnistuu) sekä kaikille epänormaaleille tuloksille (Kystinoosi: homotsygoottinen tai heterotsygoottinen 57 kb:n deleetiolle ja/tai c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homotsygoottinen ja/tai heterotsygoottinen) testi toistetaan sisäisesti vahvistusta varten olemassa olevalla verinäytteellä.

Mittaukset ja menetelmät Reaaliaikainen kvadrupleksi-PCR suoritetaan neljälle edellä kuvatulle mutaatiolle. Kystinoosi: Havaitseminen suoritetaan havaitsemalla fluoresenssileimattujen koettimien sitoutuminen tai sulamisanalyysi. Näytteissä, joiden tulos on positiivinen heterotsygoottisuusmutaatioiden vuoksi, kystinosiinigeenin (CTNS) eksonit sekvensoidaan käyttämällä seuraavan sukupolven sekvensointia (NBS) amplikonipohjaisessa menetelmässä. Tämä varmistaa, että vain haluttuja eksoneja ei tutkita muita DNA-alueita. DNA:ta, joka on jo uutettu reaaliaikaista multipleksi-PCR:ää varten, voidaan käyttää NBS:ään. NEBNext Direct Genotyping Solution -ratkaisulla peitetään kaikki CTNS-geenin analysoitavat alueet (osittainen päällekkäisyys), mikä säilyttää täydellisen sekvenssiinformaation kaikista eksoneista ja spesifisistä introneista. Siksi DNA fragmentoidaan entsymaattisesti ja liitetään sitten valaistuilla sovittimilla. Adapterit sisältävät yksittäisiä indeksejä. Myöhemmin biotiinihelmiä käytetään kohderikastukseen. Niitä täydennetään streptavidiinihelmillä. Tämän jälkeen kohteen ulkopuoliset sekvenssit poistetaan ja kirjastot monistetaan PCR:llä. Varsinainen sekvensointi suoritetaan Illuminan laitteella (MiniSeq). Sekvenssejä arvioidaan käyttämällä ohjelmistoa, joka suorittaa automaattisen vertailun referenssisekvenssiin ja havaitsee siten mutaatiot.

PH: Havaitseminen tehdään lämpöanalyysillä fluoresoivilla merkityillä johtimilla. Positiivisten tulosten tapauksessa (myös heterotsygoottisten tähdistöjen vuoksi) suunnitellaan selvennystä yhteistyössä saksalaisen hyperoksaluriakeskuksen kanssa. Siksi pistevirtsasta testataan oksalaatti ja muut glyoksylaattiaineenvaihdunnan parametrit.

Tutkimustulokset Kystinoosi: Jos CTNS:n yleisimmät mutaatiot havaitaan homotsygoottisina tai yhdistelmäheterotsygoottisina mutaatioina, kystinoosiseulonta katsotaan positiiviseksi. Seuraavan sukupolven sekvensointia käyttämällä havaitaan vielä 175 kirjallisuuteen tallennettua mutaatiota. Kaikissa muissa tapauksissa, jopa niissä, joihin liittyy heterotsygoottinen tila, kystinoosiseulonta on normaalia.

PH: Hyperoksaluria-seulonta on positiivinen, jos PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) ja/tai PH3 (HOGA-geeni: c.700+5G>T) havaitaan homotsygoottina. Heterotsygoottisessa geneettisessä kantajassa, jolla on positiivinen seulonta, myöhemmin Wisplinghoffin laboratoriossa Kölnissä (Köln) tehty virtsakoe selventää löydön.

Havaitsemisaste, väärät positiiviset ja väärät negatiiviset tulokset Yleisen havaitsemisasteen oletetaan olevan yli 95 % molemmissa sairauksissa. Väärät negatiiviset seulontatulokset ovat epätodennäköisiä.

Kystinoosin osalta vääriä negatiivisia tuloksia, jotka johtuvat aiemmin tuntemattomista harvinaisista mutaatioista tai potilaista, joilla ei ole kumpaakaan kahdesta yleisimmästä mutaatiosta.

Väärät positiiviset seulontatulokset ovat myös erittäin epätodennäköisiä. Kystinoosin yhteydessä heterotsygoottinen näyte, joka johtuu "alleelisesta poisjäännästä" (alleelin PCR-epäonnistuminen alukkeen sitoutumisalueen mutaatioista johtuen), voi näyttää virheellisesti homotsygoottiselta.

PH:ssa tauti ei ole poissuljettu heterotsygoottisen mutaation tapauksessa, lisädiagnostiikka on tarpeen ja suunniteltu.

Vastaavien oireiden sattuessa kystinoosi tai PH tulee sisällyttää erotusdiagnoosiin, joka yleensä tapahtuu jossakin harvoista hoitokeskuksista. Tällaiset tapaukset voidaan dokumentoida vain ajan mittaan vastaanottokeskusten palautteen avulla.

Diagnoosin vahvistaminen Kystinoosi: Potilailla, joilla on joko homotsygoottinen tai heterotsygoottinen yhdistemutaatio CTNS-geenissä, diagnoosi varmistetaan määrittämällä intraleukosyyttinen kystiinitaso 2,3 ml:sta EDTA-verta. Tämä näyte lähetetään Heidelbergin aineenvaihduntalaboratorioon 14 ensimmäisen elinpäivän aikana.

PH: PH1- tai PH3-geenien mutaatioiden homotsygoottisilla kantajilla seuraa pistevirtsan tai plasman kontrollitutkimus, joka suoritetaan Saksan hyperoksaluriakeskuksessa.

Varmennustestien tulokset siirretään seulontalaboratorioon laadunvalvontaa varten.

Sairastuneiden lasten hoito Kystinoosi: Positiiviset kystinoosiseulontatulokset saavat lapset ja heidän vanhempansa ohjataan lähimpään aineenvaihduntasairauksien keskukseen. Kysteamiinihoito voidaan aloittaa heti diagnoosin vahvistamisen jälkeen. Vanhemmille kerrotaan mahdollisuudesta poikkitieteelliseen kystinoosikonsultaatioon Rosenheimissa.

PH: Positiivisen seulontatuloksen saaneet lapset ohjataan ensisijaisesti Saksan hyperoksaluriakeskukseen Bonnissa.

Näiden potilaiden jatkohoito suoritetaan lähimmässä heidän valitsemassaan sairaalassa.

Hankkeen koko Taloudellisista syistä projekti on rajoitettu 200 000 näytteeseen, ja sitä voidaan laajentaa.