Genetický novorozenecký screening cystinózy a primární hyperoxalurie (GENESIS)

Pozadí a cíle. Populační screening novorozenců (NBS) je důležitým programem veřejného zdraví, který díky včasnému odhalení výrazně zlepšil průběh několika onemocnění. Výběr vyšetřovaných poruch se obecně řídí 10 principy nastíněnými Wilsonem a Jungnerem. V Německu je NBS od roku 1969 dobrovolným programem Národní zdravotní služby, který v současnosti pokrývá 17 poruch. Současné metody NBS, které využívají tandemovou hmotnostně spektrometrickou analýzu zaschlých krevních skvrn novorozenců, nemohou detekovat mnoho potenciálně léčitelných genetických stavů. Současně je NBS na molekulární bázi stále proveditelnější, protože DNA lze extrahovat ze zaschlé krevní skvrny, sekvenování nové generace se stalo ekonomickým a molekulární diagnostika má větší spolehlivost a větší validitu, protože genetické databáze jsou stále rafinovanější a komplexnější. Nefropatická cystinóza a hyperoxalurie (PH) jsou vhodné pro molekulární NBS, protože jsou k dispozici účinné terapie.

V prvním pilotním projektu již mohl být vytvořen vědecký základ pro cystinózu NBS. Cílem této studie je prokázat přenositelnost genetické NBS pro cystinózu do jiných laboratoří a položit vědecký základ pro screening PH.

Konkrétně bude studie zjišťovat, zda by zařazení těchto onemocnění do obecné NBS mělo být doporučeno. Sledováním identifikovaných kojenců ve srovnání s pacienty symptomaticky diagnostikovanými mimo pilotní projekt bude určeno, zda a do jaké míry vede časná diagnostika a terapie k příznivější prognóze.

Cystinóza Nefropatická cystinóza, způsobená narušeným transportem cystinu z lysozomů, se vyskytuje s incidencí 1 ze 100-200 000 živě narozených dětí. Je charakterizována renálním Fanconiho syndromem v prvním roce života a progresí glomerulární dysfunkce do konečného stádia onemocnění ledvin přibližně do 10 let věku. Léčba perorální terapií cysteaminem pomáhá zachovat glomerulární funkci, ale postižení jedinci nakonec vyžadují substituční terapii ledvin Léčba cysteaminem obvykle začíná v době diagnózy ve druhém roce života, ale v té době již došlo k určitému poškození glomerulů a tubulů. Tato situace by mohla být zlepšena diagnostikou pacientů krátce po narození pomocí molekulárně genetického screeningu novorozenců. Standardní metody založené na hmotnostní spektrometrii pro screening novorozenců nemohou detekovat zvýšený obsah cystinu v leukocytech cystinózy.

Pro screening cystinózy první stupeň zahrnoval multiplexní PCR k detekci dvou ze tří nejběžnějších mutací CTNS v Německu. Heterozygotní vzorky budou podrobeny sekvenování nové generace na bázi amplikonu pro 175 patogenních mutací CTNS (Labor Limbach, Mainz). Při použití tohoto přístupu se předpovídá míra detekce 96,5 %.

Primární hyperoxalurie Tři různé výchozí stavy v metabolismu glyoxylátů vedou k PH. Nejčastější variantou je těžký typ PH1 (1-3 ze 106 pacientů). Populační studie odhadují prevalenci 1:58 000. Odhadovaný počet nenahlášených případů je vysoký. Ukládání krystalů šťavelanu vápenatého v ledvinách spouští chronický zánět, který vede k terminálnímu selhání ledvin. Snížené vylučování šťavelanu močí vede k vysokým koncentracím oxalátů v plazmě a následně k ukládání šťavelanu vápenatého v orgánech a tkáních (systémová oxalóza). Klinický průběh je velmi variabilní. Jsou popsány příklady infantilní oxalózy s časnou ztrátou renálních funkcí až po a-/oligosymptomatické pacienty v dospělosti.

Klinicky je PH2 klidnější, ale asi u 50 % pacientů se vyvine konečné selhání ledvin.

PH3 byla dříve považována za mírnou variantu, ale dnes je známo, že u pacientů s PH3 se mohou objevit ledvinové kameny také v dětství a rozvinout terminální selhání ledvin se systémovou oxalózou.

Registr PH OxalEurope (European hyperoxaluria consortium) v současnosti uvádí 1137 geneticky diagnostikovaných pacientů, z toho 81,9 % s PH1, 9,8 % s PH2 a 8,4 % s PH3. V molekulárně genetickém hodnocení německého registru jsou výsledky: 74,1 % PH1, 7,9 % PH2 a 17 % PH3.

Primární hyperoxalurie byla dosud diagnostikována podle klinického nálezu analýzou moči (nebo plazmatickým testem v případě terminálního selhání ledvin). Proto je diagnóza obvykle stanovena, jakmile se u pacientů již vyvinulo terminální selhání ledvin. Ale stávající léky (vitamín B6) nebo nové léky RNAi (Lumasiran, Nedosiran) mohou zabránit selhání ledvin a učinit onemocnění léčitelným. Účelem tohoto pilotního projektu je identifikace nejčastějších mutací v genu AGXT a v genu HOGA1.

Pracovní postup Studijní populace Nemocnice v Německu si mohou svobodně vybrat mezi 11 certifikovanými laboratořemi pro NBS. V tomto projektu Screening-Laboratory Hannover informuje své odesílatele o možnosti rozšířit rutinně zřízenou NBS o genetický screening cystinózy a PH.

Studovaná populace zahrnuje novorozence, jejichž rodiče si přejí účastnit se pilotního projektu a poskytli písemný informovaný souhlas.

Informace a souhlas rodičů Před provedením screeningu jsou rodiče novorozence komplexně informováni o možnosti screeningu různých onemocnění lékařem NBS (gynekologem, pediatrem). Do informační brožury již dostupné pro běžnou NBS je vložen doplňující informační a souhlasný list pro cystinózu a screening PH. Souhlas musí být doložen podpisem alespoň jednoho rodiče a podpisem informujícího lékaře na formuláři souhlasu. Formulář souhlasu s pilotním projektem obsahuje i souhlas s předáním kontaktních údajů a nálezů do specializovaného centra v případě abnormálního výsledku screeningu. Laboratoř musí před analýzou obdržet formulář souhlasu s projektem. Výsledky, které dopadnou normálně, jsou hlášeny odpovědnému odesílajícímu lékaři podle pokynů NBS pro děti. Odesílatel musí zkontrolovat, zda existuje výsledek pro každý vzorek krve odebraný pro screening (kontrola návratu výsledku).

V případě pozitivního výsledku musí laboratoř nejprve informovat odesílatele a objasnit, zda je dítě stále hospitalizováno. V takovém případě odesílatel získá prvotní informace od rodičů a uvědomí odborníka pro příslušnou diagnózu (Cystinóza: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hyperoxalurie: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Pokud již bylo dítě propuštěno z nemocnice, laboratoř se obrátí přímo na příslušného odborníka, na kterého se vztahuje informovaný souhlas.

Odběr vzorků Molekulárně genetický screening se provádí za použití stejné karty vysušené krevní skvrny jako rutinní NBS.

Obecně platí, že pro všechny neplatné výsledky (tj. pokud kontrolní reakce selže), stejně jako všechny abnormální výsledky (cystinóza: homozygotní nebo heterozygotní pro deleci 57 kb a/nebo c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozygotní a/nebo heterozygotní) bude test interně opakován pro potvrzení s použitím existujícího vzorku krve.

Měření a metody Pro čtyři výše popsané mutace se provádí kvadruplexní PCR v reálném čase. Cystinóza: Detekce se provádí detekcí vazby nebo analýzou tání fluorescenčně značených sond. Ve vzorcích s pozitivním výsledkem v důsledku heterozygotních mutací jsou exony genu pro cystinosin (CTNS) sekvenovány pomocí sekvenování nové generace (NBS) metodou založenou na amplikonu. To zajišťuje, že jsou zkoumány pouze požadované exony a žádné další oblasti DNA. DNA již extrahovaná pro real-time multiplex PCR může být použita pro NBS. S NEBNext Direct Genotyping Solution jsou pokryty všechny analyzovatelné oblasti genu CTNS (částečné překrývání), které zachovávají kompletní sekvenční informace všech exonů a specifických intronů. Proto bude DNA enzymaticky fragmentována a poté ligována s osvětlitelnými adaptéry. Adaptéry obsahují jednotlivé indexy. Poté budou biotinové kuličky použity pro cílové obohacení. Budou doplněny kuličkami streptavidinu. Poté budou mimocílové sekvence odstraněny a knihovny budou amplifikovány pomocí PCR. Vlastní sekvenování se provádí pomocí zařízení od Illumina (MiniSeq). Sekvence jsou vyhodnoceny pomocí softwaru, který provádí automatické srovnání s referenční sekvencí, čímž detekuje mutace.

PH: Detekce bude provedena pomocí tepelné analýzy s fluorescenčně označenými vodiči. V případě pozitivních výsledků (i vzhledem k heterozygotním konstelacím) je plánováno upřesnění ve spolupráci s německým centrem hyperoxalurie. Proto bude spotová moč testována na oxalát a další parametry v metabolismu glyoxylátů.

Výsledky vyšetření Cystinóza: Pokud jsou nejčastější mutace CTNS detekovány jako homozygotní nebo složené heterozygotní mutace, je screening cystinózy považován za pozitivní. Pomocí sekvenování nové generace bude detekováno dalších 175 mutací zaznamenaných v literatuře. Ve všech ostatních případech, dokonce i těch, které zahrnují heterozygotní stav, je screening cystinózy normální.

PH: Screening hyperoxalurie je pozitivní, pokud je detekován homozygot PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) a/nebo PH3 (HOGA-gen: c.700+5G>T). U heterozygotního genetického nosiče s pozitivním screeningem objasní nález následné vyšetření moči provedené ve Wisplinghoffově laboratoři v Kolíně nad Rýnem (Köln).

Míra detekce, falešně pozitivní a falešně negativní výsledky U obou onemocnění se předpokládá celková míra detekce nad 95 %. Falešně negativní výsledky screeningu jsou nepravděpodobné.

U cystinózy jsou možné falešně negativní výsledky v důsledku dříve neznámých vzácných mutací nebo pacientů nesoucích žádnou ze dvou nejčastějších mutací.

Falešně pozitivní výsledky screeningu jsou také velmi nepravděpodobné. Při cystinóze se heterozygotní vzorek v důsledku „alelického výpadku“ (selhání PCR alely v důsledku mutací v oblasti vazby primeru) může nesprávně jevit jako homozygotní.

U PH není onemocnění vyloučeno v případě heterozygotní mutace, další diagnostika je nutná a plánovaná.

V případě odpovídajících příznaků je třeba cystinózu nebo PH zařadit do diferenciální diagnostiky, která většinou probíhá v jednom z mála léčebných center. Takové případy lze dokumentovat pouze v průběhu času prostřednictvím zpětné vazby ošetřujících center.

Potvrzení diagnózy Cystinóza: U pacientů s homozygotní nebo složenou heterozygotní mutací v genu CTNS bude diagnóza potvrzena stanovením hladiny intraleukocytárního cystinu z 2,3 ml krve EDTA. Tento vzorek bude odeslán do metabolické laboratoře v Heidelbergu během prvních 14 dnů života.

PH: U homozygotních nositelů mutací v genech PH1 nebo PH3 bude následovat kontrolní vyšetření spotové moči nebo plazmy, které bude provedeno v Německém centru hyperoxalurie.

Výsledky ověřovacích zkoušek budou předány screeningové laboratoři ke kontrole kvality.

Péče o postižené děti Cystinóza: Děti s pozitivními výsledky screeningu cystinózy a jejich rodiče jsou odesíláni do nejbližšího centra pro metabolická onemocnění. Terapii cysteaminem lze zahájit ihned po potvrzení diagnózy. Rodiče jsou informováni o možnosti interdisciplinární konzultace cystinózy v Rosenheimu.

PH: Děti s pozitivním výsledkem screeningu budou primárně odeslány do německého centra hyperoxalurie v Bonnu.

Další léčba těchto pacientů se provádí v nejbližší nemocnici podle jejich výběru.

Velikost projektu Z finančních důvodů je projekt omezen na 200 000 vzorků s možností rozšíření.