Screening genetico neonatale per cistinosi e iperossaluria primaria (GENESIS)

Contesto e obiettivi. Lo screening neonatale basato sulla popolazione (NBS) è un importante programma di sanità pubblica che ha notevolmente migliorato il decorso di diverse malattie attraverso la diagnosi precoce. La selezione dei disturbi sottoposti a screening generalmente segue i 10 principi delineati da Wilson e Jungner. In Germania, NBS è un programma volontario del Servizio Sanitario Nazionale dal 1969 che copre attualmente 17 disturbi. Gli attuali metodi NBS, che impiegano l'analisi spettrometrica di massa in tandem delle macchie di sangue secco dei neonati, non sono in grado di rilevare molte condizioni genetiche potenzialmente curabili. Allo stesso tempo, l'NBS a base molecolare è sempre più fattibile perché il DNA può essere estratto da una macchia di sangue essiccato, il sequenziamento di nuova generazione è diventato economico e la diagnostica molecolare ha una maggiore affidabilità e una maggiore validità man mano che i database genetici diventano più raffinati e completi. La cistinosi nefropatica e l'iperossaluria (PH) sono eleggibili per NBS a base molecolare perché sono disponibili terapie efficaci.

In un primo progetto pilota, potrebbe già essere stabilita la base scientifica per NBS per la cistinosi. Lo scopo di questo studio è dimostrare la trasferibilità della NBS genetica per la cistinosi ad altri laboratori e gettare le basi scientifiche per lo screening della PH.

Nello specifico, lo studio indagherà se l'inclusione di queste malattie nell'NBS generale debba essere raccomandata. Osservando i bambini identificati rispetto ai pazienti diagnosticati sintomaticamente al di fuori del progetto pilota, si determinerà se e in che misura la diagnosi precoce e la terapia portino a una prognosi più favorevole.

Cistinosi La cistinosi nefropatica, dovuta al trasporto alterato della cistina fuori dai lisosomi, si verifica con un'incidenza di 1 su 100-200.000 nati vivi. È caratterizzata dalla sindrome renale di Fanconi nel primo anno di vita e dalla progressione della disfunzione glomerulare verso la malattia renale allo stadio terminale intorno ai 10 anni di età. Il trattamento con la terapia orale con cisteamina aiuta a preservare la funzione glomerulare, ma gli individui affetti alla fine richiedono una terapia sostitutiva del rene Il trattamento con cisteamina generalmente inizia al momento della diagnosi nel secondo anno di vita, ma a quel punto si è già verificato un danno glomerulare e tubulare. Questa situazione potrebbe essere migliorata diagnosticando i pazienti poco dopo la nascita, impiegando lo screening neonatale basato sulla genetica molecolare. I metodi standard basati sulla spettrometria di massa per lo screening neonatale non sono in grado di rilevare l'aumento del contenuto di cistina dei leucociti della cistinosi.

Per lo screening della cistinosi, il primo livello prevedeva la PCR multiplex per rilevare due delle tre mutazioni CTNS più comuni in Germania. I campioni eterozigoti saranno sottoposti a sequenziamento di nuova generazione basato su ampliconi per 175 mutazioni patogene di CTNS (Labor Limbach, Mainz). Utilizzando questo approccio è previsto un tasso di rilevamento del 96,5%.

Iperossaluria primaria Tre diversi difetti nel metabolismo del gliossilato portano alla IP. Il tipo grave PH1 è la variante più comune (1-3 su 106 pazienti). Gli studi basati sulla popolazione stimano una prevalenza di 1:58.000. Il numero stimato di casi non segnalati è alto. Il deposito di cristalli di ossalato di calcio nei reni innesca un'infiammazione cronica che si traduce in insufficienza renale terminale. La ridotta escrezione di ossalato nelle urine porta a concentrazioni elevate di ossalato nel plasma e successivamente a depositi di ossalato di calcio negli organi e nei tessuti (ossalosi sistemica). Il decorso clinico è molto variabile. Vengono descritti esempi di ossalosi infantile con perdita precoce della funzione renale fino a pazienti a-/oligosintomatici in età adulta.

Clinicamente, la PH2 è più calma, ma circa il 50% dei pazienti sviluppa insufficienza renale allo stadio terminale.

La PH3 era considerata una variante lieve, ma oggi è noto che i pazienti con PH3 possono anche sviluppare calcoli renali durante l'infanzia e sviluppare insufficienza renale terminale con ossalosi sistemica.

Il registro PH di OxalEurope (European hyperoxaluria consortium) elenca attualmente 1137 pazienti geneticamente diagnosticati, di cui l'81,9% con PH1, il 9,8% con PH2 e l'8,4% con PH3. Nella valutazione genetica molecolare del registro tedesco, i risultati sono: 74,1% PH1, 7,9% PH2 e 17% PH3.

Finora, l'iperossaluria primaria è stata diagnosticata in base ai risultati clinici attraverso l'analisi delle urine (o del plasma in caso di insufficienza renale terminale). Pertanto, la diagnosi viene solitamente effettuata una volta che i pazienti hanno già sviluppato un'insufficienza renale terminale. Ma i farmaci esistenti (vitamina B6) oi nuovi farmaci RNAi (Lumasiran, Nedosiran) possono prevenire l'insufficienza renale e rendere la malattia curabile. Lo scopo di questo progetto pilota è identificare le mutazioni più comuni nel gene AGXT e nel gene HOGA1.

Flusso di lavoro Popolazione dello studio Gli ospedali in Germania sono liberi di scegliere tra 11 laboratori certificati per NBS. In questo progetto, lo Screening-Laboratory di Hannover informa i suoi mittenti sulla possibilità di estendere l'NBS abitualmente stabilito dallo screening genetico per cistinosi e PH.

La popolazione in studio comprende i neonati i cui genitori desiderano partecipare al progetto pilota e hanno fornito il consenso informato scritto.

Informazioni e consenso dei genitori Prima dell'esecuzione dello screening, i genitori del neonato vengono informati in modo esauriente sulla possibilità di screening per le diverse patologie dal medico responsabile della NBS (ginecologo, pediatra). Un'ulteriore scheda informativa e di consenso per lo screening di cistinosi e PH è inserita nell'opuscolo informativo già disponibile per NBS regolare. Il consenso deve essere documentato con la firma di almeno un genitore e la firma del medico curante sul modulo di consenso. Il modulo di consenso per il progetto pilota include anche il consenso al trasferimento dei dati di contatto e dei referti a un centro specializzato in caso di risultato anomalo dello screening. Il laboratorio deve ricevere il modulo di consenso per il progetto prima dell'analisi. I risultati che risultano normali vengono segnalati al medico responsabile della presentazione secondo le linee guida NBS per i bambini. Il mittente deve verificare se esiste un risultato per ogni campione di sangue prelevato per lo screening (controllo del ritorno dell'esito).

In caso di risultato positivo, il laboratorio deve prima informare il mittente e chiarire se il bambino è ancora ricoverato. In tal caso, il mittente ottiene le prime informazioni dai genitori e notifica un esperto per la rispettiva diagnosi (Cistinosi: Priv.-Doz. Dott. med.

K.Hohenfellner, Rosenheim; Iperossaluria: Prof. Dr. med. B.Hoppe, Bonn). Se il bambino è già stato dimesso dall'ospedale, il laboratorio contatterà direttamente l'esperto competente che è coperto dal consenso informato.

Campionamento Lo screening genetico molecolare viene eseguito utilizzando la stessa scheda di prelievo di sangue essiccato dell'NBS di routine.

In generale, per tutti i risultati non validi (ovvero, se la reazione di controllo fallisce) così come per tutti i risultati anomali (cistinosi: omozigote o eterozigote per la delezione di 57 kb e/o c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7 ; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, omozigote e/o eterozigote) il test verrà ripetuto internamente per conferma utilizzando il campione di sangue esistente.

Misure e metodi Per le quattro mutazioni sopra descritte viene eseguita una PCR quadruplex in tempo reale. Cistinosi: il rilevamento viene effettuato rilevando il legame o mediante analisi di fusione di sonde marcate con fluorescenza. Nei campioni con un risultato positivo dovuto a mutazioni di eterozigosi, gli esoni del gene della cistinosina (CTNS) vengono sequenziati utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NBS) in un metodo basato su ampliconi. Ciò garantisce che vengano esaminati solo gli esoni desiderati e nessun'altra area del DNA. Il DNA già estratto per PCR multiplex in tempo reale può essere utilizzato per NBS. Con NEBNext Direct Genotyping Solution tutte le aree analizzabili del gene CTNS sono coperte (sovrapposizione parziale), che conserva un'informazione di sequenza completa di tutti gli esoni e introni specifici. Pertanto, il DNA sarà frammentato enzimaticamente e quindi legato con adattatori illuminabili. Gli adattatori contengono indici individuali. Successivamente le sfere di biotina verranno utilizzate per l'arricchimento del target. Saranno aumentati con granuli di streptavidina. Successivamente le sequenze fuori bersaglio saranno rimosse e le librerie saranno amplificate mediante PCR. Il sequenziamento effettivo viene eseguito utilizzando un dispositivo di Illumina (MiniSeq). Le sequenze vengono valutate utilizzando un software che esegue un confronto automatico con una sequenza di riferimento, rilevando così le mutazioni.

PH: Il rilevamento sarà effettuato mediante analisi del calore con puntali marcati fluorescenti. In caso di esito positivo (anche per costellazioni eterozigoti) è previsto un chiarimento in collaborazione con il centro tedesco di iperossaluria. Pertanto, l'urina spot sarà testata per l'ossalato e altri parametri nel metabolismo del gliossilato.

Risultati dell'esame Cistinosi: se le mutazioni più frequenti di CTNS vengono rilevate come mutazioni omozigoti o eterozigoti composte, lo screening della cistinosi è considerato positivo. Utilizzando il sequenziamento di nuova generazione, verranno rilevate altre 175 mutazioni registrate in letteratura. In tutti gli altri casi, anche quelli che coinvolgono lo stato eterozigote, lo screening della cistinosi è normale.

PH: Lo screening dell'iperossaluria è positivo se PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) e/o PH3 (HOGA-gene: c.700+5G>T) è rilevato come omozigote. Nel portatore genetico eterozigote con screening positivo, un successivo esame delle urine effettuato presso il laboratorio Wisplinghoff di Colonia (Köln) chiarirà il dato.

Tasso di rilevamento, risultati falsi positivi e falsi negativi Si presume un tasso di rilevamento complessivo superiore al 95% per entrambe le malattie. I risultati di screening falsi negativi sono improbabili.

Per la cistinosi, sono possibili risultati falsi negativi dovuti a mutazioni rare precedentemente sconosciute o pazienti portatori di nessuna delle due mutazioni più frequenti.

Anche i risultati di screening falsi positivi sono molto improbabili. Con la cistinosi, un campione eterozigote a causa del "dropout allelico" (fallimento della PCR di un allele dovuto a mutazioni nella regione di legame del primer) può apparire erroneamente omozigote.

In PH, la malattia non è esclusa in caso di mutazione eterozigote, è necessaria e pianificata un'ulteriore diagnostica.

In caso di sintomi corrispondenti, la cistinosi o l'IP devono essere incluse nella diagnosi differenziale, che di solito si svolge in uno dei pochi centri di cura. Tali casi possono essere documentati solo nel corso del tempo tramite il feedback dei centri di accoglienza possono essere documentati.

Conferma della diagnosi Cistinosi: nei pazienti con una mutazione omozigote o eterozigote composta nel gene CTNS, la diagnosi sarà confermata determinando il livello di cistina intraleucocitica da 2,3 ml di sangue EDTA. Questo campione verrà inviato al laboratorio metabolico di Heidelberg entro i primi 14 giorni di vita.

PH: Nei portatori omozigoti delle mutazioni nei geni PH1 o PH3, seguirà un esame di controllo dell'urina spot o del plasma, che sarà effettuato presso il Centro tedesco per l'iperossaluria.

I risultati dei test di verifica saranno trasferiti al laboratorio di screening per il controllo di qualità.

Prendersi cura dei bambini affetti Cistinosi: i bambini con risultati positivi allo screening per la cistinosi ei loro genitori vengono indirizzati al centro per le malattie metaboliche più vicino. La terapia con cisteamina può essere iniziata immediatamente dopo la conferma della diagnosi. I genitori vengono informati della possibilità di una consulenza interdisciplinare sulla cistinosi a Rosenheim.

PH: I bambini con un risultato positivo allo screening saranno indirizzati principalmente al centro tedesco per l'iperossaluria di Bonn.

L'ulteriore trattamento di questi pazienti viene eseguito presso l'ospedale più vicino di loro scelta.

Dimensioni del progetto Per motivi finanziari, il progetto è limitato a 200.000 campioni, con possibilità di espansione.