Genetisk nyföddscreening för cystinos och primär hyperoxaluri (GENESIS)

Bakgrund och mål. Populationsbaserad screening av nyfödda (NBS) är ett viktigt folkhälsoprogram som avsevärt har förbättrat förloppet av flera sjukdomar genom tidig upptäckt. Urvalet av screenade störningar följer i allmänhet de 10 principerna som skisserats av Wilson och Jungner. I Tyskland har NBS varit ett frivilligt National Health Service-program sedan 1969 som för närvarande täcker 17 sjukdomar. Nuvarande NBS-metoder, som använder tandemmasspektrometrisk analys av torkade blodfläckar från nyfödda, kan inte upptäcka många potentiellt behandlingsbara genetiska tillstånd. Samtidigt är molekylärbaserad NBS alltmer genomförbart eftersom DNA kan extraheras från en torkad blodfläck, nästa generations sekvensering har blivit ekonomisk och molekylär diagnostik har större tillförlitlighet och ökad validitet i takt med att genetiska databaser blir mer förfinade och heltäckande. Nefropatisk cystinos och hyperoxaluri (PH) är kvalificerade för molekylärbaserad NBS eftersom effektiva terapier finns tillgängliga.

I ett första pilotprojekt kunde den vetenskapliga grunden för NBS för cystinos redan fastställas. Syftet med denna studie är att demonstrera överförbarheten av genetisk NBS för cystinos till andra laboratorier och att lägga den vetenskapliga grunden för screening för PH.

Specifikt kommer studien att undersöka om inkludering av dessa sjukdomar i allmän NBS bör rekommenderas. Genom att observera de identifierade spädbarnen i jämförelse med patienter som symtomatiskt diagnostiserats utanför pilotprojektet kommer det att fastställas om och i vilken utsträckning tidig diagnos och terapi leder till en mer gynnsam prognos.

Cystinos Nefropatisk cystinos, på grund av försämrad transport av cystin ut ur lysosomer, förekommer med en incidens på 1 av 100-200 000 levande födda. Det kännetecknas av njure Fanconis syndrom under det första levnadsåret och glomerulär dysfunktion progression till njursjukdom i slutstadiet vid cirka 10 års ålder. Behandling med oral cysteaminterapi hjälper till att bevara glomerulär funktion, men drabbade individer kräver så småningom njurersättningsterapi Cysteaminbehandling börjar i allmänhet vid diagnostillfället under det andra levnadsåret, men vissa glomerulära och tubulära skador har redan inträffat då. Denna situation skulle kunna förbättras genom att diagnostisera patienter kort efter födseln, genom att använda molekylärgenetikbaserad screening för nyfödda. Standardmasspektrometribaserade metoder för screening av nyfödda kan inte detektera det ökade cystininnehållet i cystinosleukocyter.

För cystinosscreening involverade den första nivån multiplex PCR för att detektera två av de tre vanligaste CTNS-mutationerna i Tyskland. Heterozygota prover kommer att skickas till amplikonbaserad nästa generations sekvensering för 175 patogena CTNS-mutationer (Labor Limbach, Mainz). En detektionsgrad på 96,5 % förutsägs med detta tillvägagångssätt.

Primär hyperoxaluri Tre olika standardvärden i glyoxylatmetabolismen leder till PH. Den svåra typen PH1 är den vanligaste varianten (1-3 av 106 patienter). Populationsbaserade studier uppskattar en prevalens på 1:58 000. Det uppskattade antalet orapporterade fall är högt. Avlagringen av kalciumoxalatkristaller i njurarna utlöser en kronisk inflammation som resulterar i terminal njursvikt. Minskad oxalatutsöndring i urinen leder till höga oxalatkoncentrationer i plasma och därefter avlagringar av kalciumoxalat i organ och vävnad (systemisk oxalos). Det kliniska förloppet är mycket varierande. Exempel på infantil oxalos med tidig njurfunktionsförlust upp till a-/oligosymptomatiska patienter i vuxen ålder beskrivs.

Kliniskt är PH2 lugnare, men cirka 50 % av patienterna utvecklar njursvikt i slutstadiet.

PH3 ansågs tidigare vara en mild variant, men det är idag känt att PH3-patienter även kan utveckla njursten i barndomen och utveckla terminal njursvikt med en systemisk oxalos.

PH-registret för OxalEurope (European hyperoxaluria consortium) listar för närvarande 1137 genetiskt diagnostiserade patienter, varav 81,9 % med PH1, 9,8 % med PH2 och 8,4 % med PH3. I den molekylärgenetiska utvärderingen av det tyska registret är resultaten: 74,1 % PH1, 7,9 % PH2 och 17 % PH3.

Hittills har primär hyperoxaluri diagnostiserats enligt kliniska fynd genom urinanalys (eller plasmatest vid terminal njursvikt). Därför ställs diagnosen vanligtvis när patienterna redan har utvecklat terminal njursvikt. Men befintliga mediciner (Vitamin B6) eller de nya RNAi-läkemedlen (Lumasiran, Nedosiran) kan förhindra njursvikt och gör sjukdomen behandlingsbar. Syftet med detta pilotprojekt är att identifiera de vanligaste mutationerna i AGXT-genen och i HOGA1-genen.

Arbetsflödesstudiepopulation Sjukhus i Tyskland kan fritt välja mellan 11 certifierade laboratorier för NBS. I detta projekt informerar Screening-Laboratory Hannover sina avsändare om möjligheten att utöka den rutinmässigt etablerade NBS med genetisk screening för cystinos och PH.

Studiepopulationen inkluderar nyfödda vars föräldrar önskar delta i pilotprojektet och har lämnat skriftligt informerat samtycke.

Förälderinformation och samtycke Innan screening görs informeras den nyföddas föräldrar utförligt om möjligheten till screening för de olika sjukdomarna av den läkare som ansvarar för NBS (gynekologen, barnläkaren). Ett ytterligare informations- och samtyckesblad för cystinos och PH-screening infogas i den informationsbroschyr som redan finns tillgänglig för vanlig NBS. Samtycke ska dokumenteras med underskrift av minst en förälder och undertecknande av den informerande läkaren på samtyckesblanketten. Samtyckesformuläret för pilotprojektet innehåller även samtycke till överföring av kontaktuppgifter och fynd till ett specialiserat centrum vid onormalt screeningresultat. Laboratoriet ska få medgivandeformuläret för projektet innan analys. Resultat som visar sig normala rapporteras till ansvarig inlämningsläkare enligt NBS riktlinjer för barn. Avsändaren ska kontrollera om det finns ett resultat för varje blodprov som tas för screening (resultatreturkontroll).

Vid positivt resultat ska laboratoriet först informera avsändaren och klargöra om barnet fortfarande är inlagt på sjukhus. I så fall får avsändaren den första informationen från föräldrarna och meddelar en expert för respektive diagnos (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hyperoxaluri: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Om barnet redan har skrivits ut från sjukhuset kommer laboratoriet att kontakta relevant expert direkt som omfattas av det informerade samtycket.

Provtagning Den molekylärgenetiska screeningen utförs med samma torkade blodfläckskort som rutinen NBS.

I allmänhet, för alla ogiltiga resultat (dvs. om kontrollreaktionen misslyckas) såväl som alla onormala resultat (cystinos: homozygot eller heterozygot för 57-kb deletionen och/eller c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozygot och/eller heterozygot) kommer testet att upprepas internt för bekräftelse med det befintliga blodprovet.

Mätningar och metoder En realtids quadruplex PCR utförs för de fyra mutationerna som beskrivs ovan. Cystinos: Detektion utförs genom detektion av bindningen eller genom smältanalys av fluorescensmärkta prober. I prover med positivt resultat på grund av heterozygositetsmutationer sekvenseras exonerna av cystinosingenen (CTNS) med hjälp av nästa generations sekvensering (NBS) i en amplikonbaserad metod. Detta säkerställer att endast de önskade exonerna och inga andra DNA-områden undersöks. DNA som redan extraherats för multiplex-PCR i realtid kan användas för NBS. Med NEBNext Direct Genotyping Solution täcks alla analyserbara områden av CTNS-genen (delvis överlappande), vilket bevarar en fullständig sekvensinformation för alla exoner och specifika introner. Därför kommer DNA:t att fragmenteras enzymatiskt och sedan ligeras med belysningsbara adaptrar. Adaptrarna innehåller individuella index. Efteråt kommer biotinpärlorna att användas för målanrikningen. De kommer att utökas med streptavidinpärlor. Efteråt kommer sekvenser utanför målet att tas bort, och biblioteken kommer att amplifieras med PCR. Själva sekvenseringen utförs med hjälp av en enhet från Illumina (MiniSeq). Sekvenserna utvärderas med hjälp av en mjukvara som utför en automatisk jämförelse med en referenssekvens och därigenom detekterar mutationer.

PH: Detektionen kommer att göras genom värmeanalys med fluorescerande märkta avledningar. Vid positiva resultat (även på grund av heterozygotiska konstellationer) planeras ett klargörande i samarbete med det tyska hyperoxaluricentret. Därför kommer punkturin att testas för oxalat och ytterligare parametrar i glyoxylatmetabolismen.

Undersökningsresultat Cystinos: Om de vanligaste mutationerna av CTNS detekteras som homozygota eller sammansatta heterozygota mutationer, anses cystinosscreeningen vara positiv. Med hjälp av nästa generations sekvensering kommer ytterligare 175 mutationer som registrerats i litteraturen att detekteras. I alla andra fall, även de som involverar heterozygot status, är cystinosscreening normal.

PH: Hyperoxaluriscreeningen är positiv om PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) och/eller PH3 (HOGA-gen: c.700+5G>T) är homozygot detekteras. Hos heterozygot genetisk bärare med positiv screening kommer ett efterföljande urintest utfört i Wisplinghoff-laboratoriet i Köln (Köln) att klargöra fyndet.

Detektionsgrad, falskt positiva och falskt negativa resultat En total upptäcktsgrad på över 95 % antas för båda sjukdomarna. Falskt negativa screeningsresultat är osannolikt.

För cystinos är falskt negativa resultat på grund av tidigare okända sällsynta mutationer eller patienter som inte bär på någon av de två vanligaste mutationerna möjliga.

Falskt positiva screeningresultat är också mycket osannolikt. Med cystinos kan ett heterozygott prov på grund av "alleliskt bortfall" (PCR-fel av en allel på grund av mutationer i primerbindningsregionen) felaktigt verka homozygot.

Vid PH är sjukdomen inte utesluten vid heterozygot mutation, ytterligare diagnostik är nödvändig och planerad.

Vid motsvarande symtom ska cystinos eller PH ingå i differentialdiagnosen, som vanligtvis sker på någon av få behandlingscentra. Sådana fall kan endast dokumenteras över tid genom att återkoppling från vårdcentralerna kan dokumenteras.

Bekräftelse av diagnosen Cystinos: Hos patienter med antingen en homozygot eller sammansatt heterozygot mutation i CTNS-genen, kommer diagnosen att bekräftas genom att bestämma den intraleukocytiska cystinnivån från 2,3 ml EDTA-blod. Detta prov kommer att skickas till metabola laboratoriet i Heidelberg inom de första 14 dagarna av livet.

PH: Hos homozygota bärare av mutationerna i PH1- eller PH3-generna följer en kontrollundersökning av prickurin eller av plasma, som kommer att utföras i det tyska hyperoxaluricentret.

Resultaten av verifieringstesterna kommer att överföras till screeninglaboratoriet för kvalitetskontroll.

Vård av drabbade barn Cystinos: Barn med positiva cystinosscreeningsresultat och deras föräldrar hänvisas till närmaste centrum för metabola sjukdomar. Behandling med cysteamin kan påbörjas omedelbart efter bekräftelse av diagnosen. Föräldrar informeras om möjligheten till en tvärvetenskaplig cystinoskonsultation i Rosenheim.

PH: Barn med positivt screeningresultat kommer i första hand att remitteras till det tyska hyperoxaluricentret i Bonn.

Fortsatt behandling av dessa patienter utförs på det närmaste valfria sjukhuset.

Projektstorlek Av ekonomiska skäl är projektet begränsat till 200 000 prover, med möjlighet till expansion.