Genetische screening van pasgeborenen op cystinose en primaire hyperoxalurie (GENESIS)

Achtergrond en doelstellingen. Populatiegebaseerde screening op pasgeborenen (NBS) is een belangrijk programma voor de volksgezondheid dat het beloop van verschillende ziekten enorm heeft verbeterd door vroege opsporing. De selectie van gescreende aandoeningen volgt over het algemeen de 10 principes die zijn uiteengezet door Wilson en Jungner. In Duitsland is NBS sinds 1969 een vrijwillig National Health Service-programma dat momenteel 17 aandoeningen omvat. De huidige NBS-methoden, die gebruik maken van massaspectrometrische tandemanalyse van opgedroogde bloedvlekken bij pasgeborenen, kunnen niet veel potentieel behandelbare genetische aandoeningen detecteren. Tegelijkertijd wordt NBS op moleculaire basis steeds haalbaarder omdat DNA kan worden geëxtraheerd uit een gedroogde bloedvlek, sequencing van de volgende generatie economisch is geworden en moleculaire diagnostiek een grotere betrouwbaarheid en grotere validiteit heeft naarmate genetische databases verfijnder en uitgebreider worden. Nefropathische cystinose en hyperoxalurie (PH) komen in aanmerking voor moleculaire NBS omdat er effectieve therapieën beschikbaar zijn.

In een eerste pilootproject kon de wetenschappelijke onderbouwing voor NBS voor cystinose reeds gelegd worden. Het doel van deze studie is om de overdraagbaarheid van genetische NBS voor cystinose naar andere laboratoria aan te tonen en de wetenschappelijke basis te leggen voor screening op PH.

In het bijzonder zal de studie onderzoeken of opname van deze ziekten in algemene NBS moet worden aanbevolen. Door de geïdentificeerde zuigelingen te observeren in vergelijking met patiënten die buiten de pilot om symptomatisch zijn gediagnosticeerd, wordt bepaald of en in hoeverre vroege diagnose en therapie leiden tot een gunstigere prognose.

Cystinose Nefropathische cystinose, als gevolg van een verstoord transport van cystine uit de lysosomen, komt voor bij 1 op de 100-200.000 levendgeborenen. Het wordt gekenmerkt door nier-Fanconi-syndroom in het eerste levensjaar en progressie van glomerulaire disfunctie tot nierziekte in het eindstadium tegen de leeftijd van ongeveer 10 jaar. Behandeling met orale cysteaminetherapie helpt de glomerulaire functie te behouden, maar getroffen personen hebben uiteindelijk niervervangende therapie nodig. Cysteaminebehandeling begint over het algemeen op het moment van diagnose in het tweede levensjaar, maar tegen die tijd is er al enige glomerulaire en tubulaire schade opgetreden. Deze situatie zou kunnen worden verbeterd door patiënten kort na de geboorte te diagnosticeren, door gebruik te maken van op moleculaire genetica gebaseerde screening van pasgeborenen. Standaard op massaspectrometrie gebaseerde methoden voor screening van pasgeborenen kunnen het verhoogde cystinegehalte van cystinose-leukocyten niet detecteren.

Voor cystinosescreening omvatte de eerste laag multiplex-PCR om twee van de drie meest voorkomende CTNS-mutaties in Duitsland te detecteren. Heterozygote monsters zullen worden onderworpen aan op amplicon gebaseerde sequencing van de volgende generatie voor 175 pathogene CTNS-mutaties (Labor Limbach, Mainz). Met deze aanpak wordt een detectiepercentage van 96,5% voorspeld.

Primaire hyperoxalurie Drie verschillende gebreken in het glyoxylaatmetabolisme leiden tot PH. Het ernstige type PH1 is de meest voorkomende variant (1-3 van de 106 patiënten). Populatiestudies schatten een prevalentie van 1:58.000. Het geschatte aantal niet-gemelde gevallen is hoog. De afzetting van calciumoxalaatkristallen in de nieren veroorzaakt een chronische ontsteking die resulteert in terminaal nierfalen. Verminderde oxalaatuitscheiding in de urine leidt tot hoge oxalaatconcentraties in het plasma en vervolgens tot afzetting van calciumoxalaat in de organen en weefsels (systemische oxalose). Het klinische beloop is zeer variabel. Voorbeelden van infantiele oxalose met vroeg nierfunctieverlies tot a-/oligosymptomatische patiënten op volwassen leeftijd worden beschreven.

Klinisch is PH2 rustiger, maar ongeveer 50% van de patiënten ontwikkelt eindstadium nierfalen.

Vroeger werd PH3 als een milde variant beschouwd, maar tegenwoordig is bekend dat PH3-patiënten ook nierstenen kunnen ontwikkelen in de kindertijd en terminaal nierfalen kunnen ontwikkelen met een systemische oxalose.

Het PH-register van OxalEurope (Europees hyperoxalurie-consortium) vermeldt momenteel 1137 genetisch gediagnosticeerde patiënten, waarvan 81,9% met PH1, 9,8% met PH2 en 8,4% met PH3. In de moleculair genetische evaluatie van het Duitse register zijn de resultaten: 74,1% PH1, 7,9% PH2 en 17% PH3.

Tot nu toe is primaire hyperoxalurie gediagnosticeerd op basis van klinische bevindingen door middel van urine-analyse (of plasmatest in geval van terminaal nierfalen). Daarom wordt de diagnose meestal gesteld als patiënten al terminaal nierfalen hebben ontwikkeld. Maar bestaande medicijnen (vitamine B6) of de nieuwe RNAi-medicijnen (Lumasiran, Nedisiran) kunnen nierfalen voorkomen en maken de ziekte behandelbaar. Het doel van dit pilootproject is om de meest voorkomende mutaties in het AGXT-gen en in het HOGA1-gen te identificeren.

Workflow Onderzoekspopulatie Ziekenhuizen in Duitsland kunnen vrij kiezen uit 11 gecertificeerde laboratoria voor NBS. In dit project informeert het Screening-Laboratorium Hannover zijn afzenders over de mogelijkheid om de routinematig vastgestelde NBS uit te breiden met de genetische screening op cystinose en PH.

De onderzoekspopulatie omvat pasgeborenen van wie de ouders willen deelnemen aan het proefproject en schriftelijke geïnformeerde toestemming hebben gegeven.

Ouderinformatie en toestemming Voordat de screening wordt uitgevoerd, worden de ouders van de pasgeborene uitgebreid geïnformeerd over de mogelijkheid van screening op de verschillende ziekten door de verantwoordelijke arts voor NBS (gynaecoloog, kinderarts). Een aanvullende informatie- en toestemmingsfiche voor cystinose en PH-screening is opgenomen in de reeds beschikbare informatiebrochure voor reguliere NBS. Toestemming moet worden gedocumenteerd met de handtekening van ten minste één ouder en de handtekening van de informerende arts op het toestemmingsformulier. In het toestemmingsformulier voor het pilotproject is ook toestemming opgenomen voor het doorgeven van contactgegevens en bevindingen aan een gespecialiseerd centrum bij een afwijkende screeningsuitslag. Voorafgaand aan de analyse moet het laboratorium het toestemmingsformulier voor het project ontvangen. Uitslagen die normaal blijken te zijn, worden volgens de NBS-richtlijnen voor kinderen gerapporteerd aan de verantwoordelijke indienende arts. De afzender dient van elk afgenomen bloedmonster voor screening te controleren of er een uitslag is (uitslagretourcontrole).

Bij een positieve uitslag moet het laboratorium eerst de afzender informeren en verduidelijken of het kind nog in het ziekenhuis ligt. In dat geval krijgt de zender de eerste informatie van de ouders en verwittigt een deskundige voor de betreffende diagnose (Cystinosis: Priv.-Doz. dr. med.

K.Hohenfellner, Rosenheim; Hyperoxalurie: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Als het kind al uit het ziekenhuis is ontslagen, neemt het laboratorium rechtstreeks contact op met de betrokken deskundige die onder de geïnformeerde toestemming valt.

Bemonstering De moleculair genetische screening wordt uitgevoerd met dezelfde gedroogde bloedvlekkaart als de standaard NBS.

In het algemeen geldt voor alle ongeldige resultaten (d.w.z. als de controlereactie mislukt) en voor alle abnormale resultaten (cystinose: homozygoot of heterozygoot voor de deletie van 57 kb en/of c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7 ; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozygoot en/of heterozygoot) wordt de test intern ter bevestiging herhaald met het bestaande bloedmonster.

Metingen en methoden Een real-time quadruplex PCR wordt uitgevoerd voor de vier hierboven beschreven mutaties. Cystinose: Detectie wordt uitgevoerd door detectie van de binding of door smeltanalyse van fluorescentie-gelabelde sondes. In monsters met een positief resultaat als gevolg van heterozygositeitsmutaties, worden de exons van het cystinosine-gen (CTNS) gesequenced met behulp van next generation sequencing (NBS) in een op amplicon gebaseerde methode. Dit zorgt ervoor dat alleen de gewenste exons en geen andere DNA-gebieden worden onderzocht. DNA dat al is geëxtraheerd voor real-time multiplex-PCR kan worden gebruikt voor NBS. Met NEBNext Direct Genotyping Solution worden alle analyseerbare gebieden van het CTNS-gen gedekt (gedeeltelijke overlapping), waardoor een volledige sequentie-informatie van alle exons en specifieke introns behouden blijft. Daarom wordt het DNA enzymatisch gefragmenteerd en vervolgens geligeerd met verlichtbare adapters. De adapters bevatten individuele indexen. Daarna worden de biotinekorrels gebruikt voor de doelverrijking. Ze zullen worden aangevuld met streptavidine-korrels. Daarna zullen off-target sequenties worden verwijderd en zullen de bibliotheken worden geamplificeerd door middel van PCR. De eigenlijke sequencing wordt uitgevoerd met behulp van een apparaat van Illumina (MiniSeq). De sequenties worden geëvalueerd met behulp van software die een automatische vergelijking uitvoert met een referentiesequentie, waardoor mutaties worden gedetecteerd.

PH: De detectie zal worden gedaan door middel van warmteanalyse met fluorescerende gelabelde leads. Bij positieve resultaten (ook vanwege heterozygote constellaties) wordt een verduidelijking gepland in samenwerking met het Duitse hyperoxaluriecentrum. Daarom zal spoturine worden getest op oxalaat en andere parameters in het glyoxylaatmetabolisme.

Onderzoeksresultaten Cystinose: Als de meest voorkomende mutaties van CTNS worden gedetecteerd als homozygote of samengestelde heterozygote mutaties, wordt de cystinosescreening als positief beschouwd. Met behulp van next-generation sequencing zullen nog eens 175 in de literatuur geregistreerde mutaties worden gedetecteerd. In alle andere gevallen, zelfs die met een heterozygote status, is screening op cystinose normaal.

PH: De screening op hyperoxalurie is positief, als PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) en/of PH3 (HOGA-gen: c.700+5G>T) homozygoot wordt gedetecteerd. Bij heterozygote genetische dragers met positieve screening zal een daaropvolgende urinetest in het Wisplinghoff-laboratorium in Keulen (Köln) de bevinding verduidelijken.

Detectiegraad, fout-positieve en fout-negatieve uitslagen Voor beide ziekten wordt uitgegaan van een overall detectiegraad van meer dan 95%. Vals-negatieve screeningresultaten zijn onwaarschijnlijk.

Voor cystinose zijn fout-negatieve resultaten mogelijk als gevolg van voorheen onbekende zeldzame mutaties of patiënten die geen van de twee meest voorkomende mutaties dragen.

Vals positieve screeningsresultaten zijn ook zeer onwaarschijnlijk. Bij cystinose kan een heterozygoot monster als gevolg van "allelic dropout" (PCR-falen van een allel als gevolg van mutaties in het primerbindingsgebied) ten onrechte homozygoot lijken.

Bij PH is de ziekte niet uitgesloten in geval van heterozygote mutatie, verdere diagnostiek is noodzakelijk en gepland.

Bij overeenkomstige symptomen moet cystinose of PH worden opgenomen in de differentiaaldiagnose, die meestal plaatsvindt in een van de weinige behandelcentra. Dergelijke gevallen kunnen in de loop van de tijd alleen worden gedocumenteerd via feedback van de behandelende centra.

Bevestiging van de diagnose Cystinose: Bij patiënten met een homozygote of samengesteld heterozygote mutatie in het CTNS-gen wordt de diagnose bevestigd door bepaling van de intraleukocytische cystinespiegel uit 2,3 ml EDTA-bloed. Dit monster wordt binnen de eerste 14 levensdagen naar het metabolisch laboratorium in Heidelberg gestuurd.

PH: Bij homozygote dragers van de mutaties in de PH1- of PH3-genen volgt een controleonderzoek van spot-urine of van plasma, dat zal worden uitgevoerd in het Duitse hyperoxaluriecentrum.

De resultaten van de verificatietesten worden voor kwaliteitscontrole overgedragen aan het screeningslaboratorium.

Zorg voor getroffen kinderen Cystinose: Kinderen met een positieve uitslag van de cystinosescreening en hun ouders worden doorverwezen naar het dichtstbijzijnde centrum voor stofwisselingsziekten. Therapie met cysteamine kan direct na bevestiging van de diagnose worden gestart. Ouders worden geïnformeerd over de mogelijkheid van een interdisciplinair cystinoseconsult in Rosenheim.

PH: Kinderen met een positieve uitslag van de screening worden primair doorverwezen naar het Duitse centrum voor hyperoxalurie in Bonn.

De verdere behandeling van deze patiënten vindt plaats in het dichtstbijzijnde ziekenhuis van hun keuze.

Projectomvang Om financiële redenen is het project beperkt tot 200.000 monsters, met de mogelijkheid tot uitbreiding.