Triagem Genética Neonatal para Cistinose e Hiperoxalúria Primária (GENESIS)

Antecedentes e objetivos. A triagem neonatal de base populacional (NBS) é um importante programa de saúde pública que melhorou muito o curso de várias doenças por meio da detecção precoce. A seleção dos distúrbios rastreados geralmente segue os 10 princípios descritos por Wilson e Jungner. Na Alemanha, o NBS é um programa voluntário do Serviço Nacional de Saúde desde 1969, que atualmente cobre 17 distúrbios. Os métodos NBS atuais, que empregam análise de espectrometria de massa em tandem de manchas de sangue seco de recém-nascidos, não podem detectar muitas condições genéticas potencialmente tratáveis. Ao mesmo tempo, o NBS baseado em moléculas é cada vez mais viável porque o DNA pode ser extraído de um sangue seco, o sequenciamento de próxima geração tornou-se econômico e os diagnósticos moleculares têm maior confiabilidade e maior validade à medida que os bancos de dados genéticos se tornam mais refinados e abrangentes. A cistinose nefropática e a hiperoxalúria (PH) são elegíveis para NBS de base molecular porque estão disponíveis terapias eficazes.

Em um primeiro projeto piloto, a base científica para NBS para cistinose já poderia ser estabelecida. O objetivo deste estudo é demonstrar a transferibilidade do NBS genético para cistinose para outros laboratórios e estabelecer as bases científicas para a triagem de HP.

Especificamente, o estudo investigará se a inclusão dessas doenças na NBS geral deve ser recomendada. Ao observar as crianças identificadas em comparação com pacientes diagnosticados sintomaticamente fora do projeto piloto, será determinado se e em que medida o diagnóstico e a terapia precoces levam a um prognóstico mais favorável.

Cistinose A cistinose nefropática, devido ao transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, ocorre com uma incidência de 1 em 100-200.000 nascidos vivos. Caracteriza-se por síndrome de Fanconi renal no primeiro ano de vida e progressão da disfunção glomerular para doença renal terminal por volta dos 10 anos de idade. O tratamento com terapia oral com cisteamina ajuda a preservar a função glomerular, mas os indivíduos afetados eventualmente requerem terapia de substituição renal. O tratamento com cisteamina geralmente começa no momento do diagnóstico no segundo ano de vida, mas alguns danos glomerulares e tubulares já ocorreram nessa época. Essa situação poderia ser amenizada com o diagnóstico dos pacientes logo após o nascimento, empregando a triagem neonatal baseada em genética molecular. Métodos padrão baseados em espectrometria de massa para triagem neonatal não podem detectar o aumento do conteúdo de cistina dos leucócitos de cistinose.

Para triagem de cistinose, o primeiro nível envolveu PCR multiplex para detectar duas das três mutações CTNS mais comuns na Alemanha. Amostras heterozigóticas serão submetidas a sequenciamento de última geração baseado em amplicon para 175 mutações patogênicas de CTNS (Labor Limbach, Mainz). Uma taxa de detecção de 96,5% é prevista usando essa abordagem.

Hiperoxalúria Primária Três padrões diferentes no metabolismo do glioxilato levam à HP. O tipo grave PH1 é a variante mais comum (1-3 em 106 pacientes). Estudos de base populacional estimam uma prevalência de 1:58.000. O número estimado de casos não notificados é alto. O depósito de cristais de oxalato de cálcio nos rins desencadeia uma inflamação crônica que resulta em insuficiência renal terminal. A diminuição da excreção de oxalato na urina leva a altas concentrações de oxalato no plasma e subsequentemente depósitos de oxalato de cálcio nos órgãos e tecidos (oxalose sistêmica). O curso clínico é altamente variável. São descritos exemplos de oxalose infantil com perda precoce da função renal até pacientes a-/oligossintomáticos na idade adulta.

Clinicamente, o PH2 é mais calmo, mas cerca de 50% dos pacientes desenvolvem insuficiência renal terminal.

A PH3 costumava ser considerada uma variante leve, mas hoje sabe-se que pacientes com PH3 também podem desenvolver cálculos renais na infância e desenvolver insuficiência renal terminal com oxalose sistêmica.

O registro de PH da OxalEurope (consórcio europeu de hiperoxalúria) lista atualmente 1.137 pacientes geneticamente diagnosticados, incluindo 81,9% com PH1, 9,8% com PH2 e 8,4% com PH3. Na avaliação genética molecular do registro alemão, os resultados são: 74,1% PH1, 7,9% PH2 e 17% PH3.

Até agora, a hiperoxalúria primária foi diagnosticada de acordo com os achados clínicos por meio de análise de urina (ou teste de plasma em caso de insuficiência renal terminal). Portanto, o diagnóstico geralmente é feito quando os pacientes já desenvolveram insuficiência renal terminal. Mas os medicamentos existentes (vitamina B6) ou os novos medicamentos de RNAi (Lumasiran, Nedosiran) podem prevenir a insuficiência renal e estão tornando a doença tratável. O objetivo deste projeto piloto é identificar as mutações mais comuns no gene AGXT e no gene HOGA1.

Fluxo de trabalho População do estudo Hospitais na Alemanha podem escolher entre 11 laboratórios certificados para NBS. Neste projeto, o Screening-Laboratory Hannover informa seus remetentes sobre a possibilidade de estender a NBS rotineiramente estabelecida pela triagem genética para cistinose e HP.

A população do estudo inclui recém-nascidos cujos pais desejam participar do projeto piloto e forneceram consentimento informado por escrito.

Informação e consentimento dos pais Antes da realização do rastreio, os pais do recém-nascido são amplamente informados sobre a possibilidade de rastreio das várias doenças pelo médico responsável pela NBS (ginecologista, pediatra). Uma folha de informações e consentimento adicional para triagem de cistinose e HP está inserida no folheto informativo já disponível para NBS regular. O consentimento deve ser documentado com a assinatura de pelo menos um dos pais e a assinatura do médico informador no formulário de consentimento. O formulário de consentimento para o projeto piloto também inclui consentimento para a transferência de dados de contato e achados para um centro especializado em caso de resultado de triagem anormal. O laboratório deve receber o formulário de consentimento para o projeto antes da análise. Os resultados normais são relatados ao médico responsável, de acordo com as diretrizes da NBS para crianças. O remetente deve verificar se há resultado para cada amostra de sangue coletada para triagem (controle de retorno de resultado).

Em caso de resultado positivo, o laboratório deve primeiro informar o remetente e esclarecer se a criança ainda está internada. Nesse caso, o remetente obtém a informação inicial dos pais e notifica um perito para o respetivo diagnóstico (Cistinose: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hiperoxalúria: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Se a criança já teve alta do hospital, o laboratório entrará em contato diretamente com o especialista relevante, que está coberto pelo consentimento informado.

Amostragem A triagem genética molecular é realizada usando o mesmo cartão de amostra de sangue seco que o NBS de rotina.

Em geral, para todos os resultados inválidos (ou seja, se a reação de controle falhar), bem como todos os resultados anormais (cistinose: homozigoto ou heterozigoto para a deleção de 57 kb e/ou c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7 ; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozigoto e/ou heterozigoto) o teste será repetido internamente para confirmação usando a amostra de sangue existente.

Medições e métodos Um PCR quádruplo em tempo real é realizado para as quatro mutações descritas acima. Cistinose: A detecção é realizada por detecção da ligação ou por análise de fusão de sondas marcadas com fluorescência. Nas amostras com resultado positivo devido a mutações de heterozigosidade, os éxons do gene da cistinosina (CTNS) são sequenciados usando sequenciamento de próxima geração (NBS) em um método baseado em amplicon. Isso garante que apenas os éxons desejados e nenhuma outra área de DNA seja examinada. O DNA já extraído para PCR multiplex em tempo real pode ser usado para NBS. Com NEBNext Direct Genotyping Solution todas as áreas analisáveis ​​do gene CTNS são cobertas (sobreposição parcial), que preservam uma informação completamente sequencial de todos os éxons e íntrons específicos. Portanto, o DNA será fragmentado enzimaticamente e depois ligado com adaptadores ilumináveis. Os adaptadores contêm índices individuais. Posteriormente, as esferas de biotina serão utilizadas para o enriquecimento do alvo. Eles serão aumentados com grânulos de estreptavidina. Posteriormente, as sequências fora do alvo serão removidas e as bibliotecas serão amplificadas por PCR. O sequenciamento real é realizado usando um dispositivo da Illumina (MiniSeq). As sequências são avaliadas por meio de um software que faz uma comparação automática com uma sequência de referência, detectando mutações.

PH: A detecção será feita através de análise de calor com cabos fluorescentes marcados. Em caso de resultados positivos (também devido a constelações heterozigóticas), um esclarecimento é planejado em colaboração com o centro alemão de hiperoxalúria. Portanto, a urina spot será testada para oxalato e outros parâmetros no metabolismo do glioxilato.

Resultados do exame Cistinose: Se as mutações mais frequentes de CTNS forem detectadas como mutações homozigóticas ou heterozigóticas compostas, o rastreio de cistinose é considerado positivo. Usando o sequenciamento de última geração, serão detectadas 175 mutações adicionais registradas na literatura. Em todos os outros casos, mesmo naqueles que envolvem status heterozigoto, a triagem de cistinose é normal.

PH: A triagem de hiperoxalúria é positiva, se PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) e/ou PH3 (HOGA-gene: c.700+5G>T) for homozigoto detectado. No portador genético heterozigoto com triagem positiva, um teste de urina subsequente realizado no laboratório Wisplinghoff em Colônia (Köln) esclarecerá o achado.

Taxa de detecção, resultados falsos positivos e falsos negativos Uma taxa de detecção geral superior a 95% é assumida para ambas as doenças. Resultados de triagem falsos negativos são improváveis.

Para cistinose, resultados falsos negativos devido a mutações raras previamente desconhecidas ou pacientes portadores de nenhuma das duas mutações mais frequentes são possíveis.

Resultados de triagem falsos positivos também são muito improváveis. Com cistinose, uma amostra heterozigótica devido a "abandono alélico" (falha de PCR de um alelo devido a mutações na região de ligação do primer) pode parecer incorretamente homozigótica.

Na HP, a doença não é excluída em caso de mutação heterozigótica, diagnósticos adicionais são necessários e planejados.

Em caso de sintomas correspondentes, cistinose ou HP devem ser incluídos no diagnóstico diferencial, que geralmente ocorre em um dos poucos centros de tratamento. Tais casos só podem ser documentados ao longo do tempo por meio de feedback dos centros de atendimento.

Confirmação do diagnóstico Cistinose: Em doentes com uma mutação homozigótica ou heterozigótica composta no gene CTNS, o diagnóstico será confirmado pela determinação do nível de cistina intraleucocitária a partir de 2,3 ml de sangue com EDTA. Esta amostra será enviada para o laboratório metabólico em Heidelberg nos primeiros 14 dias de vida.

PH: Nos portadores homozigóticos das mutações nos genes PH1 ou PH3, seguir-se-á um exame de controlo de urina pontual ou de plasma, que será realizado no Centro Alemão de Hiperoxalúria.

Os resultados dos testes de verificação serão transferidos para o laboratório de triagem para controle de qualidade.

Cuidando de crianças afetadas Cistinose: Crianças com resultados positivos na triagem de cistinose e seus pais são encaminhados para o centro de doenças metabólicas mais próximo. A terapia com cisteamina pode ser iniciada imediatamente após a confirmação do diagnóstico. Os pais são informados sobre a possibilidade de uma consulta interdisciplinar de cistinose em Rosenheim.

PH: Crianças com resultado de triagem positivo serão encaminhadas principalmente para o centro alemão de hiperoxalúria em Bonn.

O tratamento adicional desses pacientes é realizado no hospital mais próximo de sua escolha.

Tamanho do projeto Por questões financeiras, o projeto está limitado a 200.000 amostras, com possibilidade de expansão.