Genetisches Neugeborenen-Screening auf Cystinose und primäre Hyperoxalurie (GENESIS)

Hintergrund und Ziele. Das populationsbasierte Neugeborenen-Screening (NBS) ist ein wichtiges öffentliches Gesundheitsprogramm, das den Verlauf mehrerer Krankheiten durch Früherkennung erheblich verbessert hat. Die Auswahl der gescreenten Erkrankungen folgt im Allgemeinen den 10 Prinzipien, die von Wilson und Jungner umrissen wurden. In Deutschland ist NBS seit 1969 ein freiwilliges Programm des Nationalen Gesundheitsdienstes, das derzeit 17 Erkrankungen abdeckt. Gegenwärtige NBS-Methoden, die eine Tandem-Massenspektrometrie-Analyse getrockneter Blutflecken von Neugeborenen verwenden, können viele potenziell behandelbare genetische Zustände nicht erkennen. Gleichzeitig ist molekularbasiertes NBS zunehmend machbar, da DNA aus einem getrockneten Blutfleck extrahiert werden kann, die Sequenzierung der nächsten Generation wirtschaftlich geworden ist und die molekulare Diagnostik eine größere Zuverlässigkeit und Aussagekraft hat, da genetische Datenbanken immer verfeinerter und umfassender werden. Nephropathische Cystinose und Hyperoxalurie (PH) kommen für eine molekularbasierte NBS in Frage, da wirksame Therapien verfügbar sind.

In einem ersten Pilotprojekt konnten bereits die wissenschaftlichen Grundlagen für NBS bei Cystinose geschaffen werden. Ziel dieser Studie ist es, die Übertragbarkeit genetischer NBS für Cystinose auf andere Labore zu demonstrieren und die wissenschaftliche Basis für ein Screening auf PH zu legen.

Konkret soll in der Studie untersucht werden, ob die Aufnahme dieser Erkrankungen in die allgemeine NBS empfohlen werden sollte. Durch die Beobachtung der identifizierten Säuglinge im Vergleich zu außerhalb des Pilotprojekts symptomatisch diagnostizierten Patienten soll ermittelt werden, ob und inwieweit eine frühzeitige Diagnose und Therapie zu einer günstigeren Prognose führen.

Cystinose Nephropathische Cystinose tritt aufgrund eines gestörten Transports von Cystin aus Lysosomen mit einer Inzidenz von 1 von 100–200.000 Lebendgeburten auf. Es ist gekennzeichnet durch ein renales Fanconi-Syndrom im ersten Lebensjahr und eine Progression der glomerulären Dysfunktion bis zum Endstadium einer Nierenerkrankung im Alter von etwa 10 Jahren. Die Behandlung mit oraler Cysteamin-Therapie trägt zum Erhalt der glomerulären Funktion bei, aber Betroffene benötigen schließlich eine Nierenersatztherapie. Die Cysteamin-Behandlung beginnt im Allgemeinen zum Zeitpunkt der Diagnose im zweiten Lebensjahr, aber einige glomeruläre und tubuläre Schäden sind bis dahin bereits aufgetreten. Diese Situation könnte verbessert werden, indem Patienten kurz nach der Geburt mit einem molekulargenetischen Neugeborenenscreening diagnostiziert werden. Standard-Massenspektrometrie-basierte Verfahren zum Neugeborenen-Screening können den erhöhten Cystingehalt von Cystinose-Leukozyten nicht nachweisen.

Beim Cystinose-Screening wurden in der ersten Stufe mittels Multiplex-PCR zwei der drei häufigsten CTNS-Mutationen in Deutschland nachgewiesen. Heterozygote Proben werden einer Amplikon-basierten Next-Generation-Sequencing für 175 pathogene CTNS-Mutationen unterzogen (Labor Limbach, Mainz). Mit diesem Ansatz wird eine Erkennungsrate von 96,5 % prognostiziert.

Primäre Hyperoxalurie Drei verschiedene Störungen im Glyoxylatstoffwechsel führen zu einer PH. Der schwere Typ PH1 ist die häufigste Variante (1-3 von 106 Patienten). Bevölkerungsbezogene Studien schätzen eine Prävalenz von 1:58.000. Die geschätzte Dunkelziffer ist hoch. Die Ablagerung von Calciumoxalat-Kristallen in den Nieren löst eine chronische Entzündung aus, die zu terminalem Nierenversagen führt. Eine verminderte Oxalatausscheidung im Urin führt zu hohen Oxalatkonzentrationen im Plasma und in der Folge zu Ablagerungen von Calciumoxalat in Organen und Geweben (systemische Oxalose). Der klinische Verlauf ist sehr variabel. Beschrieben werden Beispiele von infantiler Oxalose mit frühem Nierenfunktionsverlust bis hin zu a-/oligosymptomatischen Patienten im Erwachsenenalter.

Klinisch ist PH2 ruhiger, aber etwa 50 % der Patienten entwickeln ein Nierenversagen im Endstadium.

Früher galt PH3 als milde Variante, heute ist jedoch bekannt, dass PH3-Patienten auch im Kindesalter Nierensteine ​​entwickeln und mit einer systemischen Oxalose ein terminales Nierenversagen entwickeln können.

Das PH-Register von OxalEurope (Europäisches Hyperoxalurie-Konsortium) listet derzeit 1137 genetisch diagnostizierte Patienten auf, davon 81,9 % mit PH1, 9,8 % mit PH2 und 8,4 % mit PH3. In der molekulargenetischen Auswertung des Deutschen Registers ergeben sich: 74,1 % PH1, 7,9 % PH2 und 17 % PH3.

Bisher wurde die primäre Hyperoxalurie nach klinischem Befund durch Urinanalyse (oder Plasmatest bei terminaler Niereninsuffizienz) diagnostiziert. Daher wird die Diagnose in der Regel gestellt, wenn die Patienten bereits eine terminale Niereninsuffizienz entwickelt haben. Aber bestehende Medikamente (Vitamin B6) oder die neuen RNAi-Medikamente (Lumasiran, Nedosiran) können Nierenversagen verhindern und machen die Krankheit behandelbar. Ziel dieses Pilotprojekts ist es, die häufigsten Mutationen im AGXT-Gen und im HOGA1-Gen zu identifizieren.

Arbeitsablauf Studienpopulation Krankenhäuser in Deutschland können zwischen 11 zertifizierten Laboren für NBS frei wählen. In diesem Projekt informiert das Screening-Labor Hannover seine Einsender über die Möglichkeit, die routinemäßig etablierten NBS um das genetische Screening auf Cystinose und PH zu erweitern.

Die Studienpopulation umfasst Neugeborene, deren Eltern an dem Pilotprojekt teilnehmen möchten und eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben haben.

Elterninformation und Einwilligung Vor Durchführung des Screenings werden die Eltern des Neugeborenen durch den NBS-verantwortlichen Arzt (Gynäkologe, Kinderarzt) umfassend über die Möglichkeiten eines Screenings auf die verschiedenen Erkrankungen aufgeklärt. Ein zusätzlicher Informations- und Einwilligungsbogen für das Cystinose- und PH-Screening wird in die bereits verfügbare Informationsbroschüre für reguläre NBS eingefügt. Die Einwilligung ist mit der Unterschrift mindestens eines Elternteils und der Unterschrift des aufklärenden Arztes auf der Einwilligungserklärung zu dokumentieren. Die Einwilligungserklärung für das Pilotprojekt beinhaltet auch die Einwilligung zur Übermittlung von Kontaktdaten und Befunden an ein spezialisiertes Zentrum im Falle eines auffälligen Screening-Ergebnisses. Das Labor muss vor der Analyse die Zustimmungserklärung für das Projekt erhalten. Normal ausfallende Ergebnisse werden gemäß den NBS-Richtlinien für Kinder dem zuständigen einsendenden Arzt gemeldet. Der Einsender muss prüfen, ob für jede zum Screening entnommene Blutprobe ein Ergebnis vorliegt (Ergebnisrückgabekontrolle).

Bei einem positiven Ergebnis muss das Labor zunächst den Einsender informieren und klären, ob das Kind noch stationär behandelt wird. In diesem Fall holt der Einsender die ersten Informationen von den Eltern ein und benachrichtigt einen Experten für die jeweilige Diagnose (Cystinose: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hyperoxalurie: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Wenn das Kind bereits aus dem Krankenhaus entlassen wurde, kontaktiert das Labor direkt den zuständigen Experten, der von der Einwilligungserklärung abgedeckt ist.

Probenahme Das molekulargenetische Screening wird mit der gleichen Trockenblutkarte durchgeführt wie die routinemäßige NBS.

Im Allgemeinen gilt für alle ungültigen Ergebnisse (d. h. wenn die Kontrollreaktion fehlschlägt) sowie für alle abnormalen Ergebnisse (Cystinose: homozygot oder heterozygot für die 57-kb-Deletion und/oder c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozygot und/oder heterozygot) wird der Test zur Bestätigung intern mit der vorhandenen Blutprobe wiederholt.

Messungen und Methoden Für die vier oben beschriebenen Mutationen wird eine Echtzeit-Quadruplex-PCR durchgeführt. Cystinose: Der Nachweis erfolgt durch Nachweis der Bindung oder durch Schmelzanalyse von fluoreszenzmarkierten Sonden. In Proben mit positivem Ergebnis aufgrund von Heterozygotie-Mutationen werden die Exons des Cystinosin-Gens (CTNS) mittels Next-Generation-Sequencing (NBS) in einem Amplikon-basierten Verfahren sequenziert. Dadurch wird sichergestellt, dass nur die gewünschten Exons und keine anderen DNA-Bereiche untersucht werden. Bereits für Real-Time Multiplex PCR extrahierte DNA kann für NBS verwendet werden. Mit NEBNext Direct Genotyping Solution werden alle analysierbaren Bereiche des CTNS-Gens abgedeckt (teilweise Überlappung), wodurch eine vollständige Sequenzinformation aller Exons und spezifischen Introns erhalten bleibt. Dazu wird die DNA enzymatisch fragmentiert und anschließend mit beleuchtbaren Adaptern ligiert. Die Adapter enthalten individuelle Indizes. Anschließend werden die Biotin-Beads für die Target-Anreicherung verwendet. Sie werden mit Streptavidin-Kügelchen verstärkt. Anschließend werden Off-Target-Sequenzen entfernt und die Bibliotheken mittels PCR amplifiziert. Die eigentliche Sequenzierung erfolgt mit einem Gerät der Firma Illumina (MiniSeq). Die Auswertung der Sequenzen erfolgt über eine Software, die einen automatischen Vergleich mit einer Referenzsequenz durchführt und so Mutationen erkennt.

PH: Der Nachweis erfolgt durch Brunstanalyse mit fluoreszierend markierten Elektroden. Bei positiven Ergebnissen (auch aufgrund heterozygoter Konstellationen) ist eine Abklärung in Zusammenarbeit mit dem Deutschen Hyperoxaluriezentrum geplant. Daher wird Spoturin auf Oxalat und weitere Parameter des Glyoxylatstoffwechsels untersucht.

Untersuchungsergebnisse Cystinose: Wenn die häufigsten Mutationen von CTNS als homozygote oder zusammengesetzte heterozygote Mutationen nachgewiesen werden, gilt das Cystinose-Screening als positiv. Mittels Next-Generation-Sequencing werden zusätzlich 175 in der Literatur erfasste Mutationen nachgewiesen. In allen anderen Fällen, auch bei heterozygotem Status, ist das Screening auf Cystinose normal.

PH: Das Hyperoxalurie-Screening ist positiv, wenn PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) und/oder PH3 (HOGA-Gen: c.700+5G>T) homozygot nachgewiesen wird. Bei heterozygoten Genträgern mit positivem Screening wird ein anschließender Urintest im Wisplinghoff-Labor in Köln den Befund klären.

Erkennungsrate, falsch positive und falsch negative Ergebnisse Für beide Erkrankungen wird von einer Gesamterkennungsrate von über 95 % ausgegangen. Falsch negative Screening-Ergebnisse sind unwahrscheinlich.

Bei Cystinose sind falsch-negative Ergebnisse aufgrund zuvor unbekannter seltener Mutationen oder Patienten, die keine der beiden häufigsten Mutationen tragen, möglich.

Falsch positive Screening-Ergebnisse sind ebenfalls sehr unwahrscheinlich. Bei Cystinose kann eine heterozygote Probe aufgrund von „Allel-Dropout“ (PCR-Versagen eines Allels aufgrund von Mutationen in der Primer-Bindungsregion) fälschlicherweise als homozygot erscheinen.

Bei PH ist die Erkrankung bei heterozygoter Mutation nicht ausgeschlossen, weitere Diagnostik ist notwendig und geplant.

Bei entsprechender Symptomatik muss eine Cystinose oder PH in die Differenzialdiagnose einbezogen werden, die meist in einem der wenigen Behandlungszentren erfolgt. Solche Fälle können im Laufe der Zeit nur über Rückmeldungen der behandelnden Zentren dokumentiert werden.

Diagnosesicherung Cystinose: Bei Patienten mit homozygoter oder compound-heterozygoter Mutation im CTNS-Gen wird die Diagnose durch Bestimmung des intraleukozytären Cystinspiegels aus 2,3 ml EDTA-Blut gesichert. Diese Probe wird innerhalb der ersten 14 Lebenstage an das Stoffwechsellabor nach Heidelberg geschickt.

PH: Bei homozygoten Trägern der Mutationen im PH1- oder PH3-Gen schließt sich eine Kontrolluntersuchung des Spoturins oder des Plasmas an, die im Deutschen Hyperoxaluriezentrum durchgeführt wird.

Die Ergebnisse der Verifizierungstests werden zur Qualitätskontrolle an das Screening-Labor übermittelt.

Betreuung betroffener Kinder Cystinose: Kinder mit positivem Cystinose-Screening-Ergebnis und ihre Eltern werden an das nächstgelegene Zentrum für Stoffwechselerkrankungen überwiesen. Die Therapie mit Cysteamin kann sofort nach Bestätigung der Diagnose begonnen werden. Eltern werden über die Möglichkeit einer interdisziplinären Cystinosesprechstunde in Rosenheim informiert.

PH: Kinder mit positivem Screening-Ergebnis werden primär an das Deutsche Hyperoxalurie-Zentrum in Bonn überwiesen.

Die weitere Behandlung dieser Patienten erfolgt im nächstgelegenen Krankenhaus ihrer Wahl.

Projektgröße Aus finanziellen Gründen ist das Projekt auf 200.000 Proben begrenzt, mit der Möglichkeit der Erweiterung.