Genetisk nyfødtscreening for cystinose og primær hyperoksaluri (GENESIS)

Bakgrunn og mål. Populasjonsbasert nyfødtscreening (NBS) er et viktig folkehelseprogram som har forbedret forløpet av flere sykdommer betydelig gjennom tidlig oppdagelse. Utvalget av screenede lidelser følger generelt de 10 prinsippene som er skissert av Wilson og Jungner. I Tyskland har NBS vært et frivillig nasjonalt helsetjenesteprogram siden 1969 som for tiden dekker 17 lidelser. Nåværende NBS-metoder, som benytter tandem massespektrometrisk analyse av tørkede blodflekker på nyfødte, kan ikke oppdage mange potensielt behandlelige genetiske tilstander. Samtidig er molekylærbasert NBS i økende grad mulig fordi DNA kan ekstraheres fra en tørket blodflekk, neste generasjons sekvensering har blitt økonomisk, og molekylær diagnostikk har større pålitelighet og økt validitet ettersom genetiske databaser blir mer raffinerte og omfattende. Nefropatisk cystinose og hyperoksaluri (PH) er kvalifisert for molekylærbasert NBS fordi effektive terapier er tilgjengelige.

I et første pilotprosjekt kunne det vitenskapelige grunnlaget for NBS for cystinose allerede etableres. Målet med denne studien er å demonstrere overførbarheten av genetisk NBS for cystinose til andre laboratorier og å legge det vitenskapelige grunnlaget for screening for PH.

Konkret vil studien undersøke om inkludering av disse sykdommene i generell NBS bør anbefales. Ved å observere de identifiserte spedbarnene sammenlignet med pasienter som er symptomatisk diagnostisert utenfor pilotprosjektet, vil det avgjøres om og i hvilken grad tidlig diagnose og terapi fører til en gunstigere prognose.

Cystinose Nefropatisk cystinose, på grunn av nedsatt transport av cystin ut av lysosomer, forekommer med en forekomst på 1 av 100-200 000 levendefødte. Det er preget av nyre Fanconi-syndrom i det første leveåret og glomerulær dysfunksjon progresjon til sluttstadium av nyresykdom ved ca. 10 års alder. Behandling med oral cysteaminterapi bidrar til å bevare glomerulær funksjon, men berørte individer krever til slutt nyreerstatningsterapi Cysteaminbehandling begynner vanligvis ved diagnosetidspunktet i det andre leveåret, men noen glomerulær og tubulær skade har allerede oppstått da. Denne situasjonen kan forbedres ved å diagnostisere pasienter kort tid etter fødselen, ved å bruke molekylærgenetikkbasert nyfødtscreening. Standard massespektrometri-baserte metoder for nyfødtscreening kan ikke oppdage økt cystininnhold i cystinose leukocytter.

For cystinosescreening involverte det første nivået multipleks PCR for å oppdage to av de tre vanligste CTNS-mutasjonene i Tyskland. Heterozygote prøver vil bli sendt til amplikonbasert neste generasjons sekvensering for 175 patogene CTNS-mutasjoner (Labor Limbach, Mainz). En deteksjonsrate på 96,5 % er spådd ved bruk av denne tilnærmingen.

Primær hyperoksaluri Tre forskjellige standardverdier i glyoksylatmetabolismen fører til PH. Den alvorlige typen PH1 er den vanligste varianten (1-3 av 106 pasienter). Populasjonsbaserte studier anslår en prevalens på 1:58 000. Det estimerte antallet urapporterte tilfeller er høyt. Avleiring av kalsiumoksalatkrystaller i nyrene utløser en kronisk betennelse som resulterer i terminal nyresvikt. Redusert oksalatutskillelse i urinen fører til høye oksalatkonsentrasjoner i plasma og påfølgende avleiringer av kalsiumoksalat i organer og vev (systemisk oksalose). Det kliniske forløpet er svært varierende. Eksempler på infantil oksalose med tidlig nyrefunksjonstap opp til a-/oligosymptomatiske pasienter i voksen alder er beskrevet.

Klinisk er PH2 roligere, men ca 50 % av pasientene utvikler nyresvikt i sluttstadiet.

PH3 ble tidligere ansett som en mild variant, men det er i dag kjent at PH3-pasienter også kan utvikle nyrestein i barndommen og utvikle terminal nyresvikt med en systemisk oksalose.

PH-registeret til OxalEurope (European hyperoxaluria consortium) viser for tiden 1137 genetisk diagnostiserte pasienter, bestående av 81,9 % med PH1, 9,8 % med PH2 og 8,4 % med PH3. I den molekylærgenetiske evalueringen av det tyske registeret er resultatene: 74,1 % PH1, 7,9 % PH2 og 17 % PH3.

Så langt har primær hyperoksaluri blitt diagnostisert i henhold til kliniske funn gjennom urinanalyse (eller plasmatest ved terminal nyresvikt). Derfor stilles diagnosen vanligvis når pasienter allerede har utviklet terminal nyresvikt. Men eksisterende medisiner (vitamin B6) eller de nye RNAi-medisinene (Lumasiran, Nedosiran) kan forhindre nyresvikt og gjør sykdommen behandlingsbar. Formålet med dette pilotprosjektet er å identifisere de vanligste mutasjonene i AGXT-genet og i HOGA1-genet.

Arbeidsflytstudiepopulasjon Sykehus i Tyskland kan fritt velge mellom 11 sertifiserte laboratorier for NBS. I dette prosjektet informerer Screening-Laboratory Hannover sine avsendere om muligheten for å utvide den rutinemessig etablerte NBS med genetisk screening for cystinose og PH.

Studiepopulasjonen inkluderer nyfødte hvis foreldre ønsker å delta i pilotprosjektet og har gitt skriftlig informert samtykke.

Foreldreinformasjon og samtykke Før screening utføres informeres den nyfødtes foreldre utfyllende om muligheten for screening for de ulike sykdommene av NBS-ansvarlig lege (gynekolog, barnelege). Et tilleggsinformasjons- og samtykkeark for cystinose og PH-screening er lagt inn i informasjonsbrosjyren som allerede er tilgjengelig for vanlig NBS. Samtykke skal dokumenteres med underskrift av minst én forelder og underskrift av informerende lege på samtykkeskjema. Samtykkeskjemaet for pilotprosjektet inneholder også samtykke til overføring av kontaktdata og funn til spesialsenter ved unormalt screeningsresultat. Laboratoriet skal motta samtykkeskjema for prosjektet før analyse. Resultater som viser seg normale rapporteres til ansvarlig innsender lege i henhold til NBS retningslinjer for barn. Avsender skal sjekke om det er resultat for hver blodprøve tatt til screening (resultatreturkontroll).

Ved positivt resultat skal laboratoriet først informere avsender og avklare om barnet fortsatt er innlagt. I så fall innhenter avsender den første informasjonen fra foreldrene og varsler en ekspert for den respektive diagnosen (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hyperoksaluri: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Dersom barnet allerede er utskrevet fra sykehus, vil laboratoriet kontakte den aktuelle sakkyndige direkte som omfattes av informert samtykke.

Prøvetaking Den molekylærgenetiske screeningen utføres ved å bruke det samme kortet med tørkede blodflekker som rutinemessig NBS.

Generelt for alle ugyldige resultater (dvs. hvis kontrollreaksjonen mislykkes) så vel som alle unormale resultater (cystinose: homozygot eller heterozygot for 57-kb-delesjonen og/eller c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozygot og/eller heterozygot) vil testen gjentas internt for bekreftelse ved bruk av eksisterende blodprøve.

Målinger og metoder En sanntids quadruplex PCR utføres for de fire mutasjonene beskrevet ovenfor. Cystinose: Påvisning utføres ved påvisning av bindingen eller ved smelteanalyse av fluorescensmerkede prober. I prøver med positivt resultat på grunn av heterozygositetsmutasjoner, sekvenseres eksonene til cystinosingenet (CTNS) ved hjelp av neste generasjons sekvensering (NBS) i en amplikonbasert metode. Dette sikrer at kun de ønskede eksonene og ingen andre DNA-områder undersøkes. DNA som allerede er ekstrahert for sanntids multipleks PCR kan brukes for NBS. Med NEBNext Direct Genotyping Solution dekkes alle analyserbare områder av CTNS-genet (delvis overlapping), som bevarer en fullstendig sekvensinformasjon for alle eksoner og spesifikke introner. Derfor vil DNA bli enzymatisk fragmentert og deretter ligeert med lysbare adaptorer. Adapterne inneholder individuelle indekser. Etterpå vil biotinkulene bli brukt til målanrikningen. De vil bli forsterket med streptavidinkuler. Etterpå vil sekvenser utenfor mål bli fjernet, og bibliotekene vil bli amplifisert ved PCR. Selve sekvenseringen utføres ved hjelp av en enhet fra Illumina (MiniSeq). Sekvensene blir evaluert ved hjelp av en programvare som utfører en automatisk sammenligning med en referansesekvens, for derved å oppdage mutasjoner.

PH: Deteksjonen vil bli gjort gjennom varmeanalyse med fluorescerende merkede ledninger. Ved positive resultater (også på grunn av heterozygotiske konstellasjoner) planlegges en avklaring i samarbeid med det tyske hyperoksalurisenteret. Derfor vil punkturin bli testet for oksalat og ytterligere parametere i glyoksylatmetabolismen.

Undersøkelsesresultater Cystinose: Hvis de hyppigste mutasjonene av CTNS påvises som homozygote eller sammensatte heterozygote mutasjoner, anses cystinosescreeningen som positiv. Ved å bruke neste generasjons sekvensering vil ytterligere 175 mutasjoner registrert i litteraturen bli oppdaget. I alle andre tilfeller, selv de som involverer heterozygot status, er cystinosescreening normal.

PH: Hyperoksaluri-screeningen er positiv hvis PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) og/eller PH3 (HOGA-gen: c.700+5G>T) er homozygot påvist. Hos heterozygot genetisk bærer med positiv screening vil en påfølgende urinprøve utført i Wisplinghoff-laboratoriet i Köln (Köln) avklare funnet.

Deteksjonsrate, falske positive og falske negative resultater Det antas en samlet deteksjonsrate på over 95 % for begge sykdommene. Falske negative screeningsresultater er usannsynlige.

For cystinose er falske negative resultater på grunn av tidligere ukjente sjeldne mutasjoner eller pasienter som ikke bærer noen av de to hyppigste mutasjonene mulig.

Falske positive screeningsresultater er også svært usannsynlige. Ved cystinose kan en heterozygot prøve på grunn av "allelisk frafall" (PCR-svikt av en allel på grunn av mutasjoner i primerbindingsregionen) feilaktig fremstå som homozygot.

Ved PH er sykdommen ikke utelukket ved heterozygot mutasjon, videre diagnostikk er nødvendig og planlagt.

Ved tilsvarende symptomer skal cystinose eller PH inkluderes i differensialdiagnosen, som vanligvis skjer på et av få behandlingssteder. Slike saker kan kun dokumenteres over tid ved at tilbakemeldinger fra møtesentrene kan dokumenteres.

Bekreftelse av diagnosen Cystinose: Hos pasienter med enten en homozygot eller sammensatt heterozygot mutasjon i CTNS-genet, vil diagnosen bekreftes ved å bestemme det intraleukocytiske cystinnivået fra 2,3 ml EDTA-blod. Denne prøven vil bli sendt til stoffskiftelaboratoriet i Heidelberg i løpet av de første 14 dagene av livet.

PH: Hos homozygote bærere av mutasjonene i PH1- eller PH3-genene vil det følge en kontrollundersøkelse av flekkurin eller av plasma, som vil bli utført i det tyske hyperoksalurisenteret.

Resultatene av verifikasjonstestene vil bli overført til screeninglaboratoriet for kvalitetskontroll.

Omsorg for berørte barn Cystinose: Barn med positive cystinosescreeningsresultater og deres foreldre henvises til nærmeste senter for stoffskiftesykdommer. Behandling med cysteamin kan startes umiddelbart etter bekreftelse av diagnosen. Foreldre informeres om muligheten for tverrfaglig cystinosekonsultasjon i Rosenheim.

PH: Barn med positivt screeningsresultat vil primært henvises til det tyske hyperoksalurisenteret i Bonn.

Videre behandling av disse pasientene utføres ved nærmeste sykehus etter eget valg.

Prosjektstørrelse Av økonomiske årsaker er prosjektet begrenset til 200 000 prøver, med mulighet for utvidelse.