Genetyczne badania przesiewowe noworodków w kierunku cystynozy i pierwotnej hiperoksalurii (GENESIS)

Tło i cele. Populacyjne badania przesiewowe noworodków (NBS) to ważny program zdrowia publicznego, który dzięki wczesnemu wykrywaniu znacznie poprawił przebieg kilku chorób. Wybór zaburzeń przesiewowych jest generalnie zgodny z 10 zasadami nakreślonymi przez Wilsona i Jungnera. W Niemczech NBS jest dobrowolnym programem Narodowej Służby Zdrowia od 1969 roku, który obecnie obejmuje 17 zaburzeń. Obecne metody NBS, które wykorzystują tandemową analizę spektrometrii masowej noworodków wysuszonych plam krwi, nie są w stanie wykryć wielu potencjalnie uleczalnych chorób genetycznych. Jednocześnie molekularna NBS jest coraz bardziej wykonalna, ponieważ DNA można wyekstrahować z wysuszonej plamki krwi, sekwencjonowanie nowej generacji stało się ekonomiczne, a diagnostyka molekularna ma większą niezawodność i ważność, ponieważ genetyczne bazy danych stają się bardziej wyrafinowane i wszechstronne. Cystynoza nefropatyczna i hiperoksaluria (PH) kwalifikują się do molekularnej NBS, ponieważ dostępne są skuteczne terapie.

W ramach pierwszego projektu pilotażowego można było już stworzyć naukowe podstawy dla NBS w leczeniu cystynozy. Celem tego badania jest wykazanie możliwości przenoszenia genetycznego NBS w przypadku cystynozy do innych laboratoriów i stworzenie podstaw naukowych do badań przesiewowych w kierunku PH.

W szczególności w ramach badania zostanie zbadane, czy należy zalecić włączenie tych chorób do ogólnej NBS. Obserwując zidentyfikowane niemowlęta w porównaniu z pacjentami zdiagnozowanymi objawowo poza projektem pilotażowym, zostanie ustalone, czy iw jakim stopniu wczesna diagnoza i terapia prowadzą do korzystniejszego rokowania.

Cystynoza Cystynoza nefropatyczna, spowodowana upośledzonym transportem cystyny ​​z lizosomów, występuje z częstością 1 na 100-200 000 żywych urodzeń. Charakteryzuje się występowaniem nerkowego zespołu Fanconiego w pierwszym roku życia i progresją dysfunkcji kłębuszków nerkowych do schyłkowej niewydolności nerek około 10 roku życia. Leczenie doustną terapią cysteaminą pomaga zachować funkcję kłębuszków nerkowych, ale osoby dotknięte chorobą ostatecznie wymagają terapii nerkozastępczej Leczenie cysteaminą zazwyczaj rozpoczyna się w momencie rozpoznania w drugim roku życia, ale do tego czasu doszło już do uszkodzenia kłębuszków nerkowych i kanalików nerkowych. Sytuację tę można poprawić, diagnozując pacjentów wkrótce po urodzeniu, stosując badania przesiewowe noworodków oparte na genetyce molekularnej. Standardowe metody badań przesiewowych noworodków oparte na spektrometrii mas nie mogą wykryć zwiększonej zawartości cystyny ​​w leukocytach cystynozy.

W przypadku badań przesiewowych cystynozy pierwszy poziom obejmował multipleksowy PCR w celu wykrycia dwóch z trzech najczęstszych mutacji CTNS w Niemczech. Heterozygotyczne próbki zostaną poddane sekwencjonowaniu nowej generacji opartemu na amplikonie pod kątem 175 patogennych mutacji CTNS (Labor Limbach, Moguncja). Przy zastosowaniu tego podejścia przewiduje się wskaźnik wykrywalności na poziomie 96,5%.

Pierwotna hiperoksaluria Trzy różne zaburzenia metabolizmu glioksylanu prowadzą do PH. Najczęstszym wariantem jest ciężki typ PH1 (1-3 na 106 pacjentów). Badania populacyjne szacują częstość występowania na 1:58 000. Szacunkowa liczba niezgłoszonych przypadków jest wysoka. Odkładanie się kryształów szczawianu wapnia w nerkach wywołuje przewlekły stan zapalny, który prowadzi do końcowej niewydolności nerek. Zmniejszone wydalanie szczawianu z moczem prowadzi do wysokiego stężenia szczawianu w osoczu, a następnie odkładania się szczawianu wapnia w narządach i tkankach (oksaloza układowa). Przebieg kliniczny jest bardzo zmienny. Opisano przykłady oksalozy dziecięcej z wczesną utratą funkcji nerek do pacjentów z objawami a-/oligosymptomatycznymi w wieku dorosłym.

Klinicznie PH2 jest spokojniejsze, ale u około 50% pacjentów rozwija się schyłkowa niewydolność nerek.

Kiedyś PH3 uważano za łagodną odmianę, ale obecnie wiadomo, że u pacjentów z PH3 mogą również rozwinąć się kamienie nerkowe w dzieciństwie i rozwinąć terminalną niewydolność nerek z ogólnoustrojową oksalozą.

Rejestr PH OxalEurope (europejskie konsorcjum hiperoksalurii) zawiera obecnie 1137 genetycznie zdiagnozowanych pacjentów, w tym 81,9% z PH1, 9,8% z PH2 i 8,4% z PH3. W ocenie genetyki molekularnej niemieckiego rejestru wyniki to: 74,1% PH1, 7,9% PH2 i 17% PH3.

Dotychczas hiperoksalurię pierwotną rozpoznawano na podstawie wyników badań klinicznych moczu (lub badania osocza w przypadku terminalnej niewydolności nerek). Dlatego diagnoza jest zwykle stawiana, gdy u pacjenta rozwinęła się już terminalna niewydolność nerek. Ale istniejące leki (witamina B6) lub nowe leki RNAi (Lumasiran, Nedosiran) mogą zapobiegać niewydolności nerek i sprawiają, że choroba jest uleczalna. Celem tego projektu pilotażowego jest identyfikacja najczęstszych mutacji w genie AGXT oraz w genie HOGA1.

Przepływ pracy Badana populacja Szpitale w Niemczech mogą swobodnie wybierać spośród 11 certyfikowanych laboratoriów dla NBS. W tym projekcie Screening-Laboratory Hannover informuje swoich nadawców o możliwości poszerzenia rutynowo zakładanego NBS o badania genetyczne w kierunku cystynozy i PH.

Badana populacja obejmuje noworodki, których rodzice chcą wziąć udział w projekcie pilotażowym i wyrazili pisemną świadomą zgodę.

Informacja i zgoda rodziców Przed wykonaniem badania przesiewowego rodzice noworodka są wszechstronnie informowani przez lekarza odpowiedzialnego za NBS (ginekologa, pediatrę) o możliwości wykonania badań przesiewowych w kierunku różnych chorób. Do broszury informacyjnej, która jest już dostępna dla regularnych NBS, dołączona jest dodatkowa karta informacyjna i zgoda na badania przesiewowe w kierunku cystynozy i PH. Zgoda musi być udokumentowana podpisem co najmniej jednego z rodziców oraz podpisem lekarza informującego na formularzu zgody. Formularz zgody na pilotaż zawiera również zgodę na przekazanie danych kontaktowych i ustaleń do specjalistycznego ośrodka w przypadku nieprawidłowego wyniku badania przesiewowego. Laboratorium musi otrzymać formularz zgody na projekt przed analizą. Wyniki, które okazują się prawidłowe, są zgłaszane do odpowiedzialnego lekarza zgłaszającego zgodnie z wytycznymi NBS dla dzieci. Nadawca musi sprawdzić, czy istnieje wynik dla każdej próbki krwi pobranej do badania przesiewowego (kontrola zwrotna wyniku).

W przypadku pozytywnego wyniku laboratorium musi najpierw poinformować nadawcę i wyjaśnić, czy dziecko jest nadal hospitalizowane. W takim przypadku nadawca uzyskuje wstępne informacje od rodziców i powiadamia eksperta o odpowiedniej diagnozie (cystynoza: Priv.-Doz. dr med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hiperoksaluria: prof. dr med. B. Hoppe, Bonn). Jeżeli dziecko zostało już wypisane ze szpitala, laboratorium skontaktuje się bezpośrednio z odpowiednim ekspertem, którego dotyczy świadoma zgoda.

Pobieranie próbek Badanie przesiewowe w zakresie genetyki molekularnej przeprowadza się przy użyciu tej samej karty z wysuszoną plamką krwi, co w przypadku rutynowego badania NBS.

Ogólnie, dla wszystkich nieważnych wyników (tj. jeśli reakcja kontrolna zawiodła), jak również wszystkich nieprawidłowych wyników (Cystynoza: homozygota lub heterozygota pod względem delecji 57 kb i/lub c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7 ; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homozygota i/lub heterozygota) test zostanie wewnętrznie powtórzony w celu potwierdzenia przy użyciu istniejącej próbki krwi.

Pomiary i metody Dla czterech mutacji opisanych powyżej przeprowadza się PCR w czasie rzeczywistym quadrupleks. Cystynoza: Wykrywanie przeprowadza się przez wykrywanie wiązania lub analizę topnienia sond znakowanych fluorescencyjnie. W próbkach z wynikiem dodatnim w wyniku mutacji heterozygotycznych eksony genu cystynozyny (CTNS) są sekwencjonowane przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji (NBS) metodą opartą na amplikonie. Zapewnia to, że badane są tylko pożądane eksony i żadne inne obszary DNA. DNA już wyekstrahowane do multipleksowego PCR w czasie rzeczywistym może być użyte do NBS. Rozwiązanie NEBNext Direct Genotyping Solution obejmuje wszystkie możliwe do analizy obszary genu CTNS (częściowe nakładanie się), co pozwala zachować pełną informację o sekwencji wszystkich eksonów i określonych intronów. Dlatego DNA zostanie enzymatycznie pofragmentowane, a następnie zligowane za pomocą naświetlanych adapterów. Adaptery zawierają indywidualne indeksy. Następnie kulki biotyny zostaną użyte do wzbogacenia celu. Zostaną wzmocnione kulkami streptawidyny. Następnie sekwencje poza celem zostaną usunięte, a biblioteki zostaną zamplifikowane metodą PCR. Właściwe sekwencjonowanie przeprowadza się przy użyciu urządzenia firmy Illumina (MiniSeq). Sekwencje są oceniane przy użyciu oprogramowania, które dokonuje automatycznego porównania z sekwencją odniesienia, wykrywając w ten sposób mutacje.

PH: Detekcja zostanie przeprowadzona za pomocą analizy termicznej z przewodami oznaczonymi fluorescencyjnie. W przypadku pozytywnych wyników (również ze względu na konstelacje heterozygotyczne) planowane jest wyjaśnienie we współpracy z niemieckim ośrodkiem hiperoksalurii. Dlatego mocz punktowy zostanie przetestowany pod kątem szczawianu i innych parametrów metabolizmu glioksylanu.

Wyniki badań Cystynoza: Jeśli najczęstsze mutacje CTNS zostaną wykryte jako mutacje homozygotyczne lub złożone heterozygotyczne, wynik badania przesiewowego w kierunku cystynozy uznaje się za pozytywny. Za pomocą sekwencjonowania nowej generacji zostanie wykrytych dodatkowe 175 mutacji zarejestrowanych w literaturze. We wszystkich innych przypadkach, nawet tych obejmujących status heterozygotyczny, badanie przesiewowe w kierunku cystynozy jest normalne.

PH: Badanie przesiewowe hiperoksalurii jest pozytywne, jeśli wykryto homozygotę PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) i/lub PH3 (gen HOGA: c.700+5G>T). W przypadku heterozygotycznego nosiciela genetycznego z pozytywnym badaniem przesiewowym, późniejsze badanie moczu przeprowadzone w laboratorium Wisplinghoff w Kolonii (Köln) wyjaśni odkrycie.

Wskaźnik wykrywalności, wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne W przypadku obu chorób zakłada się ogólny wskaźnik wykrywalności powyżej 95%. Fałszywie negatywne wyniki badań przesiewowych są mało prawdopodobne.

W przypadku cystynozy możliwe są wyniki fałszywie ujemne z powodu nieznanych wcześniej rzadkich mutacji lub pacjentów niebędących nosicielami żadnej z dwóch najczęstszych mutacji.

Fałszywie pozytywne wyniki badań przesiewowych są również bardzo mało prawdopodobne. W przypadku cystynozy heterozygotyczna próbka z powodu „porzucenia allelu” (niepowodzenie PCR allelu z powodu mutacji w regionie wiążącym starter) może nieprawidłowo wyglądać na homozygotę.

W PH choroba nie jest wykluczona w przypadku mutacji heterozygotycznej, konieczna i planowana jest dalsza diagnostyka.

W przypadku wystąpienia analogicznych objawów cystynozę lub PH należy uwzględnić w diagnostyce różnicowej, która zazwyczaj odbywa się w jednym z nielicznych ośrodków leczniczych. Takie przypadki mogą być udokumentowane tylko w miarę upływu czasu poprzez informacje zwrotne od ośrodków prowadzących.

Potwierdzenie diagnozy Cystynoza: U pacjentów z homozygotyczną lub złożoną heterozygotyczną mutacją w genie CTNS, diagnoza zostanie potwierdzona przez oznaczenie poziomu cystyny ​​wewnątrzleukocytarnej z 2,3 ml krwi EDTA. Ta próbka zostanie wysłana do laboratorium metabolicznego w Heidelbergu w ciągu pierwszych 14 dni życia.

PH: U homozygotycznych nosicieli mutacji w genach PH1 lub PH3 nastąpi kontrolne badanie moczu lub osocza, które zostanie przeprowadzone w niemieckim Centrum Hiperoksalurii.

Wyniki badań weryfikacyjnych zostaną przekazane do laboratorium przesiewowego w celu kontroli jakości.

Opieka nad dziećmi dotkniętymi cystynozą: Dzieci z dodatnimi wynikami badań przesiewowych w kierunku cystynozy oraz ich rodzice kierowani są do najbliższego ośrodka chorób metabolicznych. Terapię cysteaminą można rozpocząć natychmiast po potwierdzeniu rozpoznania. Informujemy rodziców o możliwości skorzystania z interdyscyplinarnej konsultacji w sprawie cystynozy w Rosenheim.

PH: Dzieci z pozytywnym wynikiem badań przesiewowych będą kierowane przede wszystkim do niemieckiego ośrodka hiperoksalurii w Bonn.

Dalsze leczenie tych pacjentów odbywa się w najbliższym wybranym przez nich szpitalu.

Wielkość projektu Ze względów finansowych projekt jest ograniczony do 200 000 próbek, z możliwością rozbudowy.