Tamizaje genético neonatal para cistinosis e hiperoxaluria primaria (GENESIS)

Antecedentes y objetivos. El cribado neonatal basado en la población (NBS, por sus siglas en inglés) es un importante programa de salud pública que ha mejorado enormemente el curso de varias enfermedades a través de la detección temprana. La selección de trastornos examinados generalmente sigue los 10 principios descritos por Wilson y Jungner. En Alemania, NBS ha sido un programa voluntario del Servicio Nacional de Salud desde 1969 que actualmente cubre 17 trastornos. Los métodos actuales de NBS, que emplean análisis espectrométricos de masas en tándem de manchas de sangre seca de recién nacidos, no pueden detectar muchas afecciones genéticas potencialmente tratables. Al mismo tiempo, la NBS de base molecular es cada vez más factible porque el ADN se puede extraer de una gota de sangre seca, la secuenciación de próxima generación se ha vuelto económica y los diagnósticos moleculares tienen mayor confiabilidad y mayor validez a medida que las bases de datos genéticas se vuelven más refinadas y completas. La cistinosis nefropática y la hiperoxaluria (HP) son elegibles para NBS de base molecular porque hay terapias efectivas disponibles.

En un primer proyecto piloto, ya podría establecerse la base científica de NBS para la cistinosis. El objetivo de este estudio es demostrar la transferibilidad de la NBS genética para la cistinosis a otros laboratorios y sentar las bases científicas para el cribado de la HP.

Específicamente, el estudio investigará si se debe recomendar la inclusión de estas enfermedades en las SbN generales. Al observar a los bebés identificados en comparación con los pacientes diagnosticados sintomáticamente fuera del proyecto piloto, se determinará si el diagnóstico y la terapia precoces conducen a un pronóstico más favorable y en qué medida.

Cistinosis La cistinosis nefropática, debida a la alteración del transporte de cistina fuera de los lisosomas, se presenta con una incidencia de 1 en 100-200 000 nacidos vivos. Se caracteriza por el síndrome de Fanconi renal en el primer año de vida y progresión de la disfunción glomerular a enfermedad renal en etapa terminal aproximadamente a los 10 años de edad. El tratamiento con cisteamina oral ayuda a preservar la función glomerular, pero las personas afectadas eventualmente requieren terapia de reemplazo renal. El tratamiento con cisteamina generalmente comienza en el momento del diagnóstico en el segundo año de vida, pero para entonces ya se ha producido algo de daño glomerular y tubular. Esta situación podría mejorarse diagnosticando a los pacientes poco después del nacimiento, empleando pruebas de detección de recién nacidos basadas en la genética molecular. Los métodos estándar basados ​​en espectrometría de masas para la detección de recién nacidos no pueden detectar el aumento del contenido de cistina de los leucocitos de cistinosis.

Para la detección de cistinosis, el primer nivel involucró PCR multiplex para detectar dos de las tres mutaciones de CTNS más comunes en Alemania. Las muestras heterocigotas se someterán a secuenciación de próxima generación basada en amplicones para 175 mutaciones patógenas de CTNS (Labor Limbach, Mainz). Se prevé una tasa de detección del 96,5 % con este enfoque.

Hiperoxaluria primaria Tres valores predeterminados diferentes en el metabolismo del glioxilato conducen a la HP. El tipo severo PH1 es la variante más común (1-3 de 106 pacientes). Los estudios de base poblacional estiman una prevalencia de 1:58.000. El número estimado de casos no denunciados es alto. El depósito de cristales de oxalato de calcio en los riñones desencadena una inflamación crónica que se traduce en insuficiencia renal terminal. La disminución de la excreción de oxalato en la orina conduce a altas concentraciones de oxalato en el plasma y, posteriormente, depósitos de oxalato de calcio en los órganos y tejidos (oxalosis sistémica). El curso clínico es muy variable. Se describen ejemplos de oxalosis infantil con pérdida temprana de la función renal hasta pacientes a-/oligosintomáticos en la edad adulta.

Clínicamente, el PH2 es más tranquilo, pero alrededor del 50 % de los pacientes desarrollan insuficiencia renal terminal.

La PH3 solía considerarse una variante leve, pero hoy se sabe que los pacientes con PH3 también pueden desarrollar cálculos renales en la infancia y desarrollar insuficiencia renal terminal con oxalosis sistémica.

El registro de HP de OxalEurope (consorcio europeo de hiperoxaluria) incluye actualmente 1137 pacientes diagnosticados genéticamente, de los cuales el 81,9 % con PH1, el 9,8 % con PH2 y el 8,4 % con PH3. En la evaluación genética molecular del registro alemán, los resultados son: 74,1% PH1, 7,9% PH2 y 17% PH3.

Hasta el momento, la hiperoxaluria primaria se ha diagnosticado según los hallazgos clínicos mediante análisis de orina (o prueba de plasma en caso de insuficiencia renal terminal). Por lo tanto, el diagnóstico generalmente se realiza una vez que los pacientes ya han desarrollado insuficiencia renal terminal. Pero los medicamentos existentes (Vitamina B6) o los nuevos medicamentos ARNi (Lumasiran, Nedosiran) pueden prevenir la insuficiencia renal y hacen que la enfermedad sea tratable. El objetivo de este proyecto piloto es identificar las mutaciones más comunes en el gen AGXT y en el gen HOGA1.

Flujo de trabajo Población del estudio Los hospitales de Alemania tienen la libertad de elegir entre 11 laboratorios certificados para NBS. En este proyecto, el Screening-Laboratory Hannover informa a sus remitentes sobre la posibilidad de ampliar el NBS establecido de forma rutinaria mediante el cribado genético de la cistinosis y la HP.

La población de estudio incluye recién nacidos cuyos padres desean participar en el proyecto piloto y han dado su consentimiento informado por escrito.

Información y consentimiento de los padres Antes de realizar el cribado, el médico responsable del NBS (ginecólogo, pediatra) informa exhaustivamente a los padres del recién nacido sobre la posibilidad de realizar el cribado de las diversas enfermedades. Se inserta una hoja de información y consentimiento adicional para la detección de cistinosis y HP en el folleto de información ya disponible para NBS regular. El consentimiento debe estar documentado con la firma de al menos uno de los padres y la firma del médico informante en el formulario de consentimiento. El formulario de consentimiento para el proyecto piloto también incluye el consentimiento para la transferencia de datos de contacto y hallazgos a un centro especializado en caso de un resultado de detección anormal. El laboratorio debe recibir el formulario de consentimiento para el proyecto antes del análisis. Los resultados que resultan normales se informan al médico responsable que los envió de acuerdo con las pautas de NBS para niños. El remitente debe verificar si hay un resultado para cada muestra de sangre tomada para el tamizaje (control de devolución de resultados).

En caso de un resultado positivo, el laboratorio primero debe informar al remitente y aclarar si el niño aún está hospitalizado. En ese caso, el remitente obtiene la información inicial de los padres y notifica a un experto para el diagnóstico respectivo (Cistinosis: Priv.-Doz. Dr. med.

K. Hohenfellner, Rosenheim; Hiperoxaluria: Prof. Dr. med. B. Hoppe, Bonn). Si el niño ya ha sido dado de alta del hospital, el laboratorio se pondrá en contacto directamente con el experto pertinente, lo que está cubierto por el consentimiento informado.

Muestreo El cribado genético molecular se realiza utilizando la misma tarjeta de gotas de sangre seca que la NBS de rutina.

En general, para todos los resultados no válidos (es decir, si la reacción de control falla), así como para todos los resultados anormales (cistinosis: homocigota o heterocigota para la deleción de 57 kb y/o c.18_21delGACT, p.T7Ffs*7; PH1, c .508G>A, PH3, C700+5G>T, homocigotos y/o heterocigotos) la prueba se repetirá internamente para confirmación utilizando la muestra de sangre existente.

Mediciones y métodos Se realiza una PCR cuádruplex en tiempo real para las cuatro mutaciones descritas anteriormente. Cistinosis: La detección se lleva a cabo por detección de la unión o por análisis de fusión de sondas marcadas con fluorescencia. En las muestras con resultado positivo por mutaciones de heterocigosidad, los exones del gen de la cistinosina (CTNS) se secuencian mediante secuenciación de próxima generación (NBS) en un método basado en amplicones. Esto asegura que solo se examinen los exones deseados y ninguna otra área de ADN. El ADN ya extraído para PCR multiplex en tiempo real se puede utilizar para NBS. Con NEBNext Direct Genotyping Solution, todas las áreas analizables del gen CTNS están cubiertas (superposición parcial), lo que conserva una información de secuencia completa de todos los exones e intrones específicos. Por lo tanto, el ADN se fragmentará enzimáticamente y luego se ligará con adaptadores iluminables. Los adaptadores contienen índices individuales. Posteriormente, las perlas de biotina se utilizarán para el enriquecimiento objetivo. Se complementarán con microesferas de estreptavidina. Posteriormente, se eliminarán las secuencias fuera del objetivo y las bibliotecas se amplificarán mediante PCR. La secuenciación real se lleva a cabo utilizando un dispositivo de Illumina (MiniSeq). Las secuencias se evalúan mediante un software que realiza una comparación automática con una secuencia de referencia, detectando así las mutaciones.

PH: La detección se realizará mediante análisis de calor con cables fluorescentes etiquetados. En caso de resultados positivos (también por constelaciones heterocigóticas) está prevista una aclaración en colaboración con el centro alemán de hiperoxaluria. Por lo tanto, la orina puntual se analizará para detectar oxalato y otros parámetros en el metabolismo del glioxilato.

Resultados del examen Cistinosis: Si las mutaciones más frecuentes de CTNS se detectan como mutaciones homocigotas o heterocigotas compuestas, la prueba de detección de cistinosis se considera positiva. Usando la secuenciación de próxima generación, se detectarán 175 mutaciones adicionales registradas en la literatura. En todos los demás casos, incluso aquellos que involucran un estado heterocigoto, la detección de cistinosis es normal.

PH: El cribado de hiperoxaluria es positivo, si se detecta homocigoto PH1 (AGXT-Gen:c508G>A) y/o PH3 (HOGA-gen: c.700+5G>T). En portador genético heterocigoto con cribado positivo, un análisis de orina posterior realizado en el laboratorio de Wisplinghoff en Colonia (Köln) aclarará el hallazgo.

Tasa de detección, resultados falsos positivos y falsos negativos Se supone una tasa de detección general superior al 95 % para ambas enfermedades. Los resultados de detección falsos negativos son poco probables.

Para la cistinosis, son posibles resultados falsos negativos debido a mutaciones raras previamente desconocidas o pacientes que no presentan ninguna de las dos mutaciones más frecuentes.

Los resultados de detección falsos positivos también son muy poco probables. Con la cistinosis, una muestra heterocigota debido a la "abandono alélico" (fallo en la PCR de un alelo debido a mutaciones en la región de unión del cebador) puede parecer incorrectamente homocigota.

En HP, la enfermedad no está excluida en caso de mutación heterocigota, se necesitan y planifican diagnósticos adicionales.

En caso de síntomas correspondientes, la cistinosis o HP debe incluirse en el diagnóstico diferencial, que generalmente se realiza en uno de los pocos centros de tratamiento. Dichos casos solo pueden documentarse en el transcurso del tiempo a través de los comentarios de los centros de atención.

Confirmación del diagnóstico Cistinosis: En pacientes con una mutación homocigota o heterocigota compuesta en el gen CTNS, el diagnóstico se confirmará determinando el nivel de cistina intraleucocítica a partir de 2,3 ml de sangre con EDTA. Esta muestra se enviará al laboratorio metabólico de Heidelberg dentro de los primeros 14 días de vida.

PH: En homocigotos portadores de las mutaciones en los genes PH1 o PH3, se seguirá un examen de control de orina puntual o de plasma, que se realizará en el Centro Alemán de Hiperoxaluria.

Los resultados de las pruebas de verificación se trasladarán al laboratorio de selección para el control de calidad.

Cuidado de los niños afectados Cistinosis: Los niños con resultados positivos en el tamizaje de cistinosis y sus padres son derivados al centro de enfermedades metabólicas más cercano. La terapia con cisteamina puede iniciarse inmediatamente después de la confirmación del diagnóstico. Se informa a los padres sobre la posibilidad de una consulta interdisciplinaria de cistinosis en Rosenheim.

PH: Los niños con un resultado de detección positivo serán remitidos principalmente al centro alemán de hiperoxaluria en Bonn.

El tratamiento adicional de estos pacientes se realiza en el hospital más cercano de su elección.

Tamaño del proyecto Por motivos económicos, el proyecto está limitado a 200.000 muestras, con posibilidad de ampliación.