シスチン症および脊髄性筋萎縮症の遺伝的新生児スクリーニング (GENESIS1)

集団ベースの新生児スクリーニング (NBS) は、早期発見を通じていくつかの病気の経過を大幅に改善する重要な公衆衛生プログラムです。 スクリーニングされた疾患の選択は、通常、Wilson と Jungner によって概説された 10 の原則に従います。 ドイツでは、NBS は 1969 年以来自主的な国民保健サービス プログラムであり、現在 17 の疾患をカバーしています。 現在の NBS 法では、新生児の乾燥血液斑のタンデム質量分析分析を採用していますが、治療可能な可能性のある多くの遺伝的疾患を検出することはできません。 同時に、乾燥した血液スポットから DNA を抽出できるようになり、次世代シークエンシングが経済的になり、遺伝子データベースがより洗練され包括的になるにつれて分子診断の信頼性と有効性が向上したため、分子ベースの NBS はますます実現可能性が高まっています。 腎症性シスチノーシスと脊髄性筋萎縮症（SMA）は、効果的な治療法が利用できるため、分子ベースのNBSの対象となります。

この研究は、シスチノーシスとSMAの新生児スクリーニングの科学的根拠を提供し、一般的な新生児スクリーニングにこれらの疾患を含めることが推奨されるべきかどうかを調査する予定です。 特定された乳児をパイロットプロジェクト以外の症状で診断された患者と比較して観察することにより、早期の診断と治療の開始がより良好な予後をもたらすかどうか、またどの程度までつながるかを判断します。

シスチン症：シスチン症は、リソソーム内のシスチン輸送体シスチノシンをコードするCTNS遺伝子の病的変異によって引き起こされ、リソソーム内でのシスチンの蓄積を引き起こす、罹患率と死亡率が高い稀な常染色体劣性遺伝性の全身性疾患です。 シスチン症の唯一の特異的治療法である経口システアミンによる生涯にわたるシスチン枯渇療法は、小児期の腎代替療法の利用可能性と相まって、患者の転帰を劇的に改善しました。 システアミンによる早期の開始と持続的な治療の両方が、慢性腎臓病（CKD）および末端臓器損傷への進行を遅らせるために不可欠であることを示す確かな証拠があります。

現在、シスチン症の診断は、白血球中のシスチンレベルの上昇の存在に基づいています。 この方法は NBS には適していません。

脊髄性筋萎縮症 (SMA): 脊髄性筋萎縮症は、ドイツでは出生数約 1:10,000 の割合で罹患しています。 常染色体劣性遺伝します。 脊髄性筋萎縮症の新生児は、出生後に臨床症状を示しません。

脊髄性筋萎縮症の原因は、「生存運動ニューロンタンパク質」をコードする遺伝子であるSMN1遺伝子のエクソン7の欠失です。 ホモ接合欠失では、脊髄の前角細胞が依存する機能的な SMN タンパク質が欠如しています。 ヘテロ接合性キャリアは無症状です。 機能的なSMNタンパク質の欠如は、脊髄レベルでの運動ニューロンの損傷をもたらし、重度の神経原性リモデリングおよび骨格筋の萎縮を引き起こします。

SMN1 遺伝子に加えて、ヒトはほぼ同一の隣接して位置する「偽遺伝子」である SMN2 遺伝子を持っています。 SMN1 遺伝子とは 5 塩基対だけ異なります。 十分な機能を有する SMN1 タンパク質が存在するため、健康な人間では SMN2 タンパク質は何の役割も果たしません。 SMN2 遺伝子には、遺伝子の発現を完全に停止できる分子スイッチが含まれています。 脊髄性筋萎縮症の臨床的ばらつきは、SMN2 タンパク質の発現の違いによって説明されます。 したがって、オフスイッチの阻害によるエクソン7を含むSMN2遺伝子の読み出しは、SMA患者の治療の治療標的となる。 疾患の経過にプラスの影響を与える治療法の可能性は、2015/2016年にIonis/Biogen社のアンチセンスオリゴヌクレオチドヌシネルセン（Spinraza®）を用いたプラセボ対照多施設共同研究で証明された。

臨床的に疑わしい場合のこの病気の診断は、EDTA 血液およびそこから単離された DNA からの SMN1 および SMN2 遺伝子の標的検査によって行われています。 この検査は通常、MLPA (多重ライゲーション依存性プローブ増幅) を使用して遺伝学研究室で行われます。 各サンプルには市販のキットが必要なため、この検査は新生児スクリーニングの一環としてスクリーニングするにはコストが高すぎます。

手順：

調査対象者 ドイツの病院は、新生児スクリーニングのために乾燥血斑カードを送信する 11 の認定検査機関のうちどの検査機関に送るか、またパイロット プロジェクトに参加するかどうかを自由に選択できます。

このプロジェクトでは、ミュンヘンのベッカー＆コレゲン研究所とハノーバースクリーニング研究所は、定期的に確立されている新生児スクリーニングにシスチン症（ハノーバー）またはシスチン症とSMA（ミュンヘン）の遺伝子スクリーニングを追加する可能性について送信者に通知しています。

研究対象集団には、両親がパイロットプロジェクトへの参加を希望し、書面によるインフォームドコンセントを提出した新生児が含まれる。 シスチン症および SMA スクリーニングに関する追加情報および同意書が提供されます。これには、スクリーニングのプロセスと目的、期待される利点、不参加によって起こり得る悪影響、および検査結果の重要性の説明が含まれます。 保護者には、要求があった場合にのみ、正常で目立った結果が通知されないことが通知されます。 同意は、少なくとも一方の親の署名と、同意書に通知した医師の署名とともに文書化する必要があります。 パイロットプロジェクトの同意書には、スクリーニング結果が異常だった場合の連絡先情報や所見を専門センターと共有することへの同意も含まれている。

陽性結果が得られた場合、検査機関はまず送信者に通知し、子供がまだ入院しているかどうかを明らかにする必要があります。 子供がまだ入院治療を受けている場合、送信者は親から初期情報を取得し、対応する診断について専門家に通知します。 小児がすでに退院している場合、検査機関は適切な専門家に直接連絡します（シスチノーシス：Priv.-Doz. 医学博士。 カタリーナ・ホーエンフェルナー、ローゼンハイム。 SMA: 教授、医学博士。 ヴォルフガング・ミュラー・フェルバー、ミュンヘン）。

サンプリング 分子遺伝学的スクリーニングは、通常の NBS と同じ乾燥血液カード (濾紙カード上の血液滴) を使用して実行されます。 追加の採血は必要ありません。 入手可能な材料がほとんどない場合は、通常の NBS が最初に実行され、次にシスチン症と SMA のスクリーニングが続きます。 小児科のガイドラインによれば、NBS の血液サンプルは生後 36 ～ 72 時間以内に採取する必要があります。

一般に、すべての無効な結果（つまり、対照反応が失敗した場合）およびすべての異常な結果について、入手可能な血液サンプルを使用して確認のために内部で検査が繰り返されます。 血液サンプルの品質が悪い場合（血液が少なすぎるなど）、検査機関は新しい血液サンプルを要求します。 必要な次世代シーケンスを実行するには材料が少なすぎる場合、研究室は別の乾燥血液サンプルも要求します。

測定と方法 シスチン症: シスチン症のスクリーニングでは、ドイツで最も一般的な 3 つの CTNS 変異、つまり 57kb の欠失 (ヨーロッパと北アメリカのシスチン症の約半分の原因) c.18_21delGACT、p を検出するために、第一段階でマルチプレックス PCR が実行されました。 .T7Ffs*7 および c.926dupG、p.S310Qfs*55 。 ヘテロ接合性サンプルは、101 個の病原性変異についてアンプリコンに基づく次世代シークエンシングを受けます。 このアプローチでは、96.5% の検出率が予測されます。

SMA 上記の CTNS 変異の三重 PCR は、SMN1 遺伝子のエクソン 7 を検出する別の PCR によって補完されます。 この四重鎖 PCR では、正常なサンプル (SMN1 遺伝子の両方の対立遺伝子にヘテロ接合エクソン 7 欠失がないサンプルまたはあるサンプル) について特異的なシグナルが得られます。 SMN1 遺伝子でホモ接合性エクソン 7 欠失が検出された場合、SMA スクリーニングは陽性とみなされます。 PCR 増幅が存在しないことは、機能的な SMN1 コピーが存在しないこと、つまり、新生児が罹患していることを示します。 ヘテロ接合体はこの方法では検出できません。 検出率、偽陽性および偽陰性の結果 両疾患の全体的な検出率は 95% 以上と想定されます。 偽陰性のスクリーニング結果が出る可能性は低いです。 シスチノーシスでは、これまで知られていなかった稀な変異、または患者が 3 つの最も一般的な変異のいずれも持たないことにより、偽陰性結果が生じる可能性があります。 SMA では、ヘテロ欠失と点突然変異が組み合わされた患者は考慮されません。 シスチン症または SMA の症状がある患者では、スクリーニングとは別にさらなる診断検査が行われます。

スクリーニング結果が偽陽性となる可能性も非常に低いです。 シスチン症では、「対立遺伝子ドロップアウト」（プライマー結合領域の変異による対立遺伝子の PCR 失敗）により、ヘテロ接合サンプルが誤ってホモ接合であるように見えることがあります。

診断の確定 シスチン症: CTNS 遺伝子にホモ接合性または複合ヘテロ接合性の変異が見つかった患者では、EDTA 血液から白血球内のシスチン レベルを測定することによって診断が確認されます。 このサンプルは生後 14 日以内にミュンスターの代謝検査室に送られます。

SMA: SMN1 遺伝子のエクソン 7 がホモ接合性である場合、SMA を想定する必要があります (> 50% が最も重度の経過をたどる I 型)。 SMA の重症度を分類するには、SMN-2 コピーの数を記録することによるさらなる診断が必要です。 別の血液サンプルが責任あるケアセンターからウルムの参照検査機関に送られます。 検証テストの結果は、品質管理のためにスクリーニングラボに転送されます。

罹患した子供のシスチン症のケア: シスチン症のスクリーニング結果が陽性の子供は、最寄りの代謝疾患センターに紹介されます。 診断が確定したらすぐにシステアミンによる治療が開始されます。

SMA: SMA スクリーニング結果が陽性の小児は、フォン・ハウナー博士小児病院 (バイエルン州) の社会小児科センターの神経筋疾患センター、またはエッセン大学病院とミュンスター大学病院のいずれかに紹介されます。

プロジェクトの範囲 プロジェクトは当初 200,000 サンプルに制限されていましたが、拡大の可能性があります。