Genetisk nyfødtscreening for cystinose og spinal muskelatrofi (GENESIS1)

Populationsbaseret screening af nyfødte (NBS) er et vigtigt folkesundhedsprogram, der har forbedret forløbet af adskillige sygdomme betydeligt gennem tidlig påvisning. Udvælgelsen af ​​screenede lidelser følger generelt de 10 principper, der er skitseret af Wilson og Jungner. I Tyskland har NBS været et frivilligt National Health Service-program siden 1969, som i øjeblikket dækker 17 lidelser. Nuværende NBS-metoder, som anvender tandem massespektrometrisk analyse af nyfødte tørrede blodpletter, kan ikke påvise mange potentielt behandlelige genetiske tilstande. Samtidig er molekylær-baseret NBS i stigende grad gennemførlig, fordi DNA kan udvindes fra en tørret blodplet, næste generations sekventering er blevet økonomisk, og molekylær diagnostik har større pålidelighed og øget validitet, efterhånden som genetiske databaser bliver mere raffinerede og omfattende. Nefropatisk cystinose og spinal muskelatrofi (SMA) er berettiget til molekylær-baseret NBS, fordi effektive terapier er tilgængelige.

Denne undersøgelse vil give et videnskabeligt grundlag for nyfødtscreening for cystinose og SMA og undersøge, om inddragelse af disse sygdomme i generel nyfødtscreening bør anbefales. Ved at observere identificerede spædbørn sammenlignet med symptomatisk diagnosticerede patienter uden for pilotprojektet, vil vi afgøre, om og i hvilket omfang tidlig diagnose og initiering af terapi fører til en mere gunstig prognose.

Cystinose: Cystinose er en sjælden autosomal recessiv systemisk sygdom med høj morbiditet og dødelighed forårsaget af patogene varianter i CTNS-genet, der koder for den lysosomale cystintransportør cystinosin, hvilket fører til akkumulering af cystin i lysosomet. Livslang cystinnedbrydende terapi med oral cysteamin, den eneste specifikke terapi for cystinose, har sammen med tilgængeligheden af ​​nyreudskiftningsterapi i barndommen forbedret patienternes resultater dramatisk. Der er solid evidens for, at tidlig initiering og vedvarende behandling med cysteamin begge er afgørende for at forsinke progression til kronisk nyresygdom (CKD) og end-organ skade.

I øjeblikket er diagnosen cystinose baseret på tilstedeværelsen af ​​forhøjede cystinniveauer i hvide blodlegemer. Denne metode er uegnet til NBS.

Spinal muskelatrofi (SMA): Spinal muskelatrofi har en prævalens på cirka 1:10.000 levendefødte i Tyskland. Det nedarves på en autosomal recessiv måde. Nyfødte med spinal muskelatrofi er uden kliniske symptomer efter fødslen.

Årsagen til spinal muskelatrofi er en deletion af exon 7 i SMN1-genet, det kodende gen for "overlevelsesmotorneuronproteinet". Homozygot deletion mangler det funktionelle SMN-protein, som de forreste hornceller i rygmarven er afhængige af. Heterozygote bærere er asymptomatiske. Mangel på det funktionelle SMN-protein resulterer i beskadigelse af motorneuroner på rygmarvsniveau, hvilket fører til alvorlig neurogen ombygning og atrofi af skeletmuskler.

Ud over SMN1-genet har mennesker et næsten identisk, tilstødende "pseudo-gen", SMN2-genet. Det adskiller sig kun fra SMN1-genet med 5 enkelt basepar. SMN2-proteinet spiller ingen rolle hos raske mennesker, da tilstrækkeligt med funktionelt SMN1-protein er til stede. SMN2-genet indeholder en molekylær switch, der fuldstændigt kan lukke genets ekspression ned. Den kliniske variabilitet af spinal muskelatrofi forklares ved differentiel ekspression af SMN2-proteinet. Således repræsenterer udlæsningen af ​​SMN2-genet inklusive dets exon 7 ved inhibering af off-kontakten et terapeutisk mål for behandlingen af ​​SMA-patienter. Muligheden for en terapi til positiv indflydelse på sygdomsforløbet blev påvist i det placebokontrollerede multicenterstudie med et antisense oligonukleotid nusinersen (Spinraza®) fra Ionis/Biogen i 2015/2016.

Diagnose af sygdommen i tilfælde af klinisk mistanke er foretaget ved målrettet testning af SMN1- og SMN2-generne fra EDTA-blod og DNA isoleret derfra. Testen udføres normalt i genetiske laboratorier ved hjælp af MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Fordi der kræves et kommercielt sæt til hver prøve, er testen for dyr til screening som en del af nyfødtscreening.

Procedure:

Undersøgelsespopulation Hospitaler i Tyskland kan frit vælge, hvilket af de 11 certificerede laboratorier, de sender de tørre blodpletter til nyfødtscreening, og om de vil deltage i pilotprojekter.

Becker & Kollegen-laboratoriet i München og Hannover-screeningslaboratoriet informerer i dette projekt deres afsendere om muligheden for at tilføje genetisk screening for cystinose (Hannover) eller cystinose og SMA (München) til den rutinemæssigt etablerede nyfødtscreening.

Undersøgelsespopulationen omfatter nyfødte, hvis forældre ønsker at deltage i pilotprojektet og har givet skriftligt informeret samtykke. Der gives et yderligere informations- og samtykkeark for cystinose- og SMA-screening, som indeholder en forklaring af screeningsprocessen og målsætninger, forventede fordele, mulige negative konsekvenser af manglende deltagelse og betydningen af ​​testresultaterne. Forældre informeres om, at de kun vil blive informeret om normale, ikke bemærkelsesværdige resultater efter anmodning. Samtykke skal dokumenteres med mindst én forælders underskrift og underskrift af den informerende læge på samtykkeerklæringen. Samtykkeskemaet for pilotprojektet indeholder også samtykke til at dele kontaktoplysninger og fund med et specialiseret center i tilfælde af et unormalt screeningsresultat.

Ved positivt resultat skal laboratoriet først informere afsender og afklare, om barnet stadig er indlagt eller ej. Hvis barnet stadig er i døgnbehandling, indhenter afsenderen de første oplysninger fra forældrene og meddeler en sagkyndig for den tilsvarende diagnose. Hvis barnet allerede er udskrevet fra hospitalet, kontakter laboratoriet den relevante ekspert direkte (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, München).

Prøveudtagning Molekylær genetisk screening udføres ved hjælp af det samme tørre blodkort (bloddråber på et filterpapirkort) som rutinemæssig NBS. Der kræves ingen yderligere blodopsamling. Hvis lidt materiale er tilgængeligt, udføres den almindelige NBS først, efterfulgt af screening for cystinose og SMA. Ifølge den pædiatriske retningslinje skal blodprøven til NBS tages mellem 36 og 72 timers levetid.

Generelt, for alle ugyldige resultater (dvs. hvis kontrolreaktionen mislykkes) og for alle unormale resultater gentages testen internt til bekræftelse ved hjælp af den tilgængelige blodprøve. Hvis kvaliteten af ​​blodprøven er dårlig (f.eks. for lidt blod), vil laboratoriet anmode om en ny blodprøve. Hvis der er for lidt materiale til at udføre den nødvendige næste generations sekventering, vil laboratoriet også anmode om endnu en tørret blodprøve.

Målinger og metoder Cystinose: Til cystinosescreening blev multipleks PCR udført i første fase for at påvise de tre mest almindelige CTNS-mutationer i Tyskland, dvs. en 57 kb deletion (ansvarlig for omkring halvdelen af ​​cystinose i Europa og Nordamerika) c.18_21delGACT, p. .T7Ffs*7 og c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Heterozygote prøver vil blive udsat for amplikon-baseret næste generations sekventering for 101 patogene mutationer. Denne tilgang forudsiger en detektionsrate på 96,5 %.

SMA Triplex-PCR'en for CTNS-mutationerne beskrevet ovenfor er komplementeret af en anden PCR, der detekterer exon 7 i SMN1-genet. Med denne quadruplex PCR opnås et specifikt signal for normale prøver (dem uden eller med heterozygot exon 7 deletion i begge alleler af SMN1 genet). SMA-screening betragtes som positiv, hvis en homozygot exon 7-deletion påvises i SMN1-genet. Fraværet af PCR-amplifikation indikerer fraværet af en funktionel SMN1-kopi, dvs. en påvirket nyfødt. Heterozygote individer kan ikke påvises med denne metode Detektionsrate, falsk positive og falsk negative resultater En samlet påvisningsrate på mere end 95 % antages for begge sygdomme. Falske negative screeningsresultater er usandsynlige. Ved cystinose er falsk negative resultater mulige på grund af hidtil ukendte sjældne mutationer eller patienter, der ikke bærer nogen af ​​de tre mest almindelige mutationer. Ved SMA tages der ikke hensyn til patienter, hvor en heterozygot deletion er kombineret med en punktmutation. Hos patienter med symptomer på cystinose eller SMA udføres yderligere diagnostiske tests uafhængigt af screening.

Falske positive screeningsresultater er også meget usandsynlige. Ved cystinose kan en heterozygot prøve fejlagtigt fremstå som homozygot på grund af "alleludfald" (PCR-svigt af en allel på grund af mutationer i primerbindingsregionen).

Bekræftelse af diagnose Cystinose: Hos patienter, der viser sig at have enten en homozygot eller sammensat heterozygot mutation i et CTNS-gen, bekræftes diagnosen ved at bestemme det intraleukocytiske cystinniveau fra EDTA-blod. Denne prøve sendes til stofskiftelaboratoriet i Münster inden for de første 14 dage af livet.

SMA: Hvis exon 7 i SMN1-genet er homozygot, må SMA antages (> 50 % type I med det mest alvorlige forløb). For at klassificere sværhedsgraden af ​​SMA kræves yderligere diagnostik ved at registrere antallet af SMN-2 kopier. Endnu en blodprøve vil blive sendt af det ansvarlige plejecenter til referencelaboratoriet i Ulm. Verifikationstestresultaterne sendes til screeninglaboratoriet til kvalitetskontrol.

Pleje af det ramte barn Cystinose: Børn med positive cystinosescreeningsresultater henvises til nærmeste stofskiftesygdomscenter. Behandling med cysteamin påbegyndes umiddelbart efter, at diagnosen er bekræftet.

SMA: Børn med positive SMA-screeningsresultater henvises enten til Center for Neuromuskulære Sygdomme i det Sociale Pædiatriske Center på Dr. von Hauner Children's Hospital (Bayern) eller til universitetshospitalerne i Essen og Münster.

Projektomfang Projektet var oprindeligt begrænset til 200.000 prøver med mulighed for udvidelse.