Genetikai újszülött szűrés cisztinózis és spinális izomsorvadás kimutatására (GENESIS1)

A népességalapú újszülöttszűrés (NBS) egy fontos népegészségügyi program, amely számos betegség lefolyását jelentősen javította a korai felismerés révén. A szűrt rendellenességek kiválasztása általában a Wilson és Jungner által felvázolt 10 alapelvet követi. Németországban az NBS 1969 óta egy önkéntes Nemzeti Egészségügyi Szolgálat program, amely jelenleg 17 betegségre terjed ki. A jelenlegi NBS-módszerek, amelyek az újszülöttek kiszáradt vérfoltjainak tandem tömegspektrometriás analízisét alkalmazzák, nem tudnak sok potenciálisan kezelhető genetikai állapotot kimutatni. Ugyanakkor a molekuláris alapú NBS egyre inkább megvalósítható, mert a DNS kiszáradt vérfoltból kinyerhető, a következő generációs szekvenálás gazdaságossá vált, a molekuláris diagnosztika pedig nagyobb megbízhatósággal és érvényességgel rendelkezik, ahogy a genetikai adatbázisok egyre kifinomultabbak és átfogóbbak. A nephropathiás cisztinózis és a spinális izomsorvadás (SMA) alkalmasak molekuláris alapú NBS-re, mivel hatékony terápiák állnak rendelkezésre.

Ez a tanulmány tudományos alapot nyújt az újszülöttek cisztinózis és SMA szűréséhez, és megvizsgálja, hogy javasolható-e ezeknek a betegségeknek az általános újszülöttszűrésbe való bevonása. A kísérleti projekten kívüli, tünetileg diagnosztizált betegekhez viszonyított, azonosított csecsemők megfigyelésével meghatározzuk, hogy a korai diagnózis és a terápia megkezdése kedvezőbb prognózist eredményez-e, és ha igen, milyen mértékben.

Cisztinózis: A cisztinózis egy ritka, autoszomális recesszív szisztémás betegség, magas morbiditással és mortalitással, amelyet a lizoszomális cisztin transzporter cisztinozint kódoló CTNS gén patogén variánsai okoznak, ami a cisztin felhalmozódásához vezet a lizoszómában. A cisztinózis egyetlen specifikus terápiájával, az orális ciszteaminnal végzett élethosszig tartó cisztin-kimerítő terápia, valamint a gyermekkorban elérhető vesepótló kezelés drámai módon javította a betegek kimenetelét. Szilárd bizonyítékok állnak rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a ciszteamin korai megkezdése és hosszan tartó terápia egyaránt elengedhetetlen a krónikus vesebetegség (CKD) progressziójának és a végszervkárosodásnak a késleltetéséhez.

Jelenleg a cisztinózis diagnózisa a fehérvérsejtek emelkedett cisztinszintjén alapul. Ez a módszer nem alkalmas az NBS-re.

Spinalis izomsorvadás (SMA): A spinális izomsorvadás prevalenciája körülbelül 1:10 000 élveszületésnél fordul elő Németországban. Autoszomális recesszív módon öröklődik. A spinális izomsorvadásban szenvedő újszülöttek születés után klinikai tünetek nélkül maradnak.

A spinális izomsorvadás oka a 7. exon deléciója az SMN1 génben, amely a "túlélő motoros neuron fehérjét" kódolja. A homozigóta delécióból hiányzik a funkcionális SMN fehérje, amelytől a gerincvelő elülső szarvsejtjei függenek. A heterozigóta hordozók tünetmentesek. A funkcionális SMN fehérje hiánya a motoros neuronok károsodását eredményezi a gerincvelő szintjén, ami súlyos neurogén remodellinghez és a vázizmok sorvadásához vezet.

Az SMN1 génen kívül az emberben van egy majdnem azonos, szomszédos "pszeudogén", az SMN2 gén. Csak 5 bázispárban különbözik az SMN1 géntől. Az SMN2 fehérje egészséges emberben nem játszik szerepet, mivel elegendő funkcionális SMN1 fehérje van jelen. Az SMN2 gén olyan molekuláris kapcsolót tartalmaz, amely teljesen leállíthatja a gén expresszióját. A spinális izomsorvadás klinikai variabilitását az SMN2 fehérje eltérő expressziója magyarázza. Így az SMN2 gén, beleértve a 7-es exonját is, a kikapcsolási kapcsoló gátlásával történő kiolvasása terápiás célpontot jelent az SMA-betegek kezelésében. A betegség lefolyását pozitívan befolyásoló terápia lehetőségét a 2015/2016-ban az Ionis/Biogen cég nusinersen (Spinraza®) antiszensz oligonukleotidjával végzett placebo-kontrollos, többközpontú vizsgálat bizonyította.

A betegség diagnosztizálása klinikai gyanú esetén az EDTA-vérből és az abból izolált DNS-ből származó SMN1 és SMN2 gének célzott tesztelésével történt. A tesztet általában genetikai laboratóriumokban végzik MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) alkalmazásával. Mivel minden mintához kereskedelmi készletre van szükség, a teszt túl költséges az újszülöttek szűrésének részeként történő szűréshez.

Eljárás:

Vizsgálati populáció A németországi kórházak szabadon választhatják meg, hogy a 11 tanúsított laboratórium közül melyikbe küldik el a szárazvérfolt-kártyákat újszülöttek szűrésére, és kívánnak-e részt venni kísérleti projektekben.

Ebben a projektben a müncheni Becker & Kollegen laboratórium és a hannoveri szűrőlaboratórium tájékoztatja feladóit arról, hogy a rutinszerűen kialakított újszülöttszűrés mellé a cisztinózis (Hannover) vagy a cystinosis és az SMA (München) genetikai szűrése is hozzáadható.

A vizsgált populációba azok az újszülöttek tartoznak, akiknek szülei részt kívánnak venni a kísérleti projektben, és írásos beleegyezését adtak. A cisztinózis- és SMA-szűréshez egy további információs és hozzájáruló lapot biztosítunk, amely tartalmazza a szűrés folyamatának és célkitűzéseinek magyarázatát, a várható előnyöket, a kimaradás lehetséges káros következményeit, valamint a vizsgálati eredmények jelentőségét. Tájékoztatjuk a szülőket, hogy a normális, nem figyelemre méltó eredményekről csak kérésre kapnak tájékoztatást. A hozzájárulást legalább az egyik szülő aláírásával és a tájékoztató orvos aláírásával kell dokumentálni a hozzájáruló lapon. A kísérleti projekt hozzájárulási űrlapja beleegyezését is tartalmazza a kapcsolatfelvételi adatok és az eredmények megosztása egy szakosodott központtal abban az esetben, ha rendellenes szűrési eredmény születik.

Pozitív eredmény esetén a laboratóriumnak először tájékoztatnia kell a küldőt, és tisztáznia kell, hogy a gyermek még mindig kórházban van-e vagy sem. Ha a gyermek továbbra is fekvőbeteg-kezelés alatt áll, a küldő beszerzi a kezdeti információkat a szülőktől, és szakértőt értesít a megfelelő diagnózis felállításához. Ha a gyermeket már hazaengedték a kórházból, a laboratórium közvetlenül kapcsolatba lép a megfelelő szakemberrel (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, München).

Mintavétel A molekuláris genetikai szűrést ugyanazzal a száraz vérkártyával (vércseppek egy szűrőpapír kártyán) végezzük, mint a rutin NBS-t. Nincs szükség további vérvételre. Ha kevés anyag áll rendelkezésre, először a szokásos NBS-t kell elvégezni, majd ezt követi a cisztinózis és az SMA szűrése. A gyermekgyógyászati ​​​​irányelv szerint az NBS-hez szükséges vérmintát 36 és 72 óra között kell venni.

Általánosságban elmondható, hogy minden érvénytelen eredmény (azaz, ha a kontroll reakció sikertelen) és minden rendellenes eredmény esetén a tesztet belsőleg meg kell ismételni a rendelkezésre álló vérminta felhasználásával történő megerősítés céljából. Ha a vérminta minősége rossz (pl. túl kevés a vér), a laboratórium új vérmintát kér. Ha túl kevés az anyag a szükséges következő generációs szekvenálás elvégzéséhez, a laboratórium újabb szárított vérmintát is kér.

Mérések és módszerek Cisztinózis: A cisztinózis szűréséhez az első szakaszban multiplex PCR-t végeztek a három leggyakoribb CTNS-mutáció kimutatására Németországban, azaz egy 57 kb-os deléciót (amely a cisztinózis körülbelül feléért felelős Európában és Észak-Amerikában) c.18_21delGACT, p. .T7Ffs*7 és c.926dupG, p.S310Qfs*55 . A heterozigóta mintákat amplikon alapú következő generációs szekvenálásnak vetik alá 101 patogén mutáció kimutatására. Ez a megközelítés 96,5%-os észlelési arányt jósol.

SMA A fent leírt CTNS-mutációk triplex PCR-jét egy másik PCR egészíti ki, amely az SMN1 gén 7-es exonját detektálja. Ezzel a quadruplex PCR-rel specifikus jelet kapunk a normál mintákra (azokra, amelyek nem rendelkeznek heterozigóta exon 7 delécióval, vagy amelyek az SMN1 gén mindkét alléljában vannak). Az SMA-szűrés akkor tekinthető pozitívnak, ha az SMN1 génben homozigóta 7-es exon deléciót észlelnek. A PCR-amplifikáció hiánya funkcionális SMN1-másolat, azaz érintett újszülött hiányát jelzi. A heterozigóta egyedek ezzel a módszerrel nem mutathatók ki. Kimutatási arány, álpozitív és álnegatív eredmények Mindkét betegség esetében 95%-ot meghaladó általános kimutatási arányt feltételezünk. Hamis negatív szűrési eredmény nem valószínű. Cisztinózisban álnegatív eredmények lehetségesek a korábban ismeretlen ritka mutációk vagy a három leggyakoribb mutáció egyikét sem hordozó betegek miatt. Az SMA-ban nem veszik figyelembe azokat a betegeket, akiknél a heterozigóta deléciót pontmutációval kombinálják. A cisztinózis vagy SMA tüneteiben szenvedő betegeknél a szűréstől függetlenül további diagnosztikai vizsgálatokat végeznek.

A hamis pozitív szűrési eredmények szintén nagyon valószínűtlenek. Cisztinózisban egy heterozigóta minta tévesen homozigótaként jelenhet meg az "allélkiesés" miatt (az allél PCR-hibája a primerkötő régió mutációi miatt).

A diagnózis megerősítése Cisztinózis: Azoknál a betegeknél, akiknél homozigóta vagy összetett heterozigóta mutációt találtak egy CTNS-génben, a diagnózist az intraleukocytás cisztinszint EDTA-vérből történő meghatározása erősíti meg. Ezt a mintát a münsteri metabolikus laboratóriumba küldik az élet első 14 napján.

SMA: Ha az SMN1 gén 7-es exonja homozigóta, akkor SMA-t kell feltételezni (> 50% I. típusú a legsúlyosabb lefolyással). Az SMA súlyosságának osztályozása érdekében további diagnosztikára van szükség az SMN-2 másolatok számának rögzítésével. Az illetékes gondozási központ egy másik vérmintát küld az ulmi referencialaboratóriumba. Az ellenőrző vizsgálat eredményeit minőség-ellenőrzés céljából továbbítják a szűrőlaboratóriumba.

Az érintett gyermek gondozása Cisztinózis: A pozitív cisztinózis szűrési eredménnyel rendelkező gyermekeket a legközelebbi anyagcsere-betegség központjába utalják. A ciszteamin terápiát a diagnózis megerősítése után azonnal megkezdik.

SMA: A pozitív SMA-szűrési eredménnyel rendelkező gyermekeket vagy a Dr. von Hauner Gyermekkórház Szociális Gyermekgyógyászati ​​Központjának Neuromuscularis Betegségek Központjába (Bajorország) vagy az esseni és münsteri egyetemi kórházba utalják.

A projekt hatóköre A projekt kezdetben 200 000 mintára korlátozódott, a bővítés lehetőségével.