Triagem genética neonatal para cistinose e atrofia muscular espinhal (GENESIS1)

A triagem neonatal de base populacional (NBS) é um importante programa de saúde pública que melhorou enormemente o curso de diversas doenças através da detecção precoce. A seleção dos distúrbios rastreados geralmente segue os 10 princípios delineados por Wilson e Jungner. Na Alemanha, o NBS é um programa voluntário do Serviço Nacional de Saúde desde 1969, que abrange atualmente 17 doenças. Os métodos atuais de NBS, que empregam análise espectrométrica de massa em tandem de manchas de sangue seco de recém-nascidos, não conseguem detectar muitas condições genéticas potencialmente tratáveis. Ao mesmo tempo, as NBS de base molecular são cada vez mais viáveis ​​porque o ADN pode ser extraído de uma amostra de sangue seco, a sequenciação da próxima geração tornou-se económica e os diagnósticos moleculares têm maior fiabilidade e maior validade à medida que as bases de dados genéticas se tornam mais refinadas e abrangentes. A cistinose nefropática e a atrofia muscular espinhal (AME) são elegíveis para NBS de base molecular porque estão disponíveis terapias eficazes.

Este estudo fornecerá uma base científica para a triagem neonatal para cistinose e AME e investigará se a inclusão dessas doenças na triagem neonatal geral deve ser recomendada. Ao observar crianças identificadas em comparação com pacientes com diagnóstico sintomático fora do projeto piloto, determinaremos se e em que medida o diagnóstico precoce e o início da terapia levam a um prognóstico mais favorável.

Cistinose: A cistinose é uma doença sistêmica autossômica recessiva rara com alta morbidade e mortalidade causada por variantes patogênicas no gene CTNS que codifica o transportador lisossômico de cistina cistinosina, levando ao acúmulo de cistina no lisossomo. A terapia de depleção de cistina ao longo da vida com cisteamina oral, a única terapia específica para cistinose, juntamente com a disponibilidade de terapia de substituição renal na infância, melhorou dramaticamente os resultados dos pacientes. Há evidências robustas de que o início precoce e a terapia sustentada com cisteamina são essenciais para retardar a progressão para doença renal crônica (DRC) e danos a órgãos-alvo.

Atualmente, o diagnóstico de cistinose é baseado na presença de níveis elevados de cistina nos glóbulos brancos. Este método não é adequado para NBS.

Atrofia Muscular Espinhal (AME): A atrofia muscular espinhal tem uma prevalência de aproximadamente 1:10.000 nascidos vivos na Alemanha. É herdado de maneira autossômica recessiva. Os recém-nascidos com atrofia muscular espinhal não apresentam sintomas clínicos após o nascimento.

A causa da atrofia muscular espinhal é uma deleção do éxon 7 no gene SMN1, o gene que codifica a "proteína do neurônio motor de sobrevivência". A deleção homozigótica não possui a proteína SMN funcional da qual dependem as células do corno anterior da medula espinhal. Portadores heterozigotos são assintomáticos. A falta da proteína SMN funcional resulta em danos aos neurônios motores ao nível da medula espinhal, levando a remodelamento neurogênico grave e atrofia dos músculos esqueléticos.

Além do gene SMN1, os humanos têm um "pseudogene" quase idêntico e localizado adjacentemente, o gene SMN2. Ele difere do gene SMN1 apenas em 5 pares de bases únicas. A proteína SMN2 não desempenha nenhum papel em humanos saudáveis, uma vez que está presente proteína SMN1 funcional suficiente. O gene SMN2 contém um interruptor molecular que pode interromper completamente a expressão do gene. A variabilidade clínica da atrofia muscular espinhal é explicada pela expressão diferencial da proteína SMN2. Assim, a leitura do gene SMN2 incluindo o seu éxon 7 pela inibição do interruptor representa um alvo terapêutico para o tratamento de pacientes com AME. A possibilidade de uma terapia influenciar positivamente o curso da doença foi demonstrada no estudo multicêntrico controlado por placebo com um oligonucleotídeo antisense nusinersen (Spinraza®) da Ionis/Biogen em 2015/2016.

O diagnóstico da doença em casos de suspeita clínica tem sido feito por meio de testes direcionados dos genes SMN1 e SMN2 do sangue EDTA e do DNA deles isolado. O teste geralmente é realizado em laboratórios de genética usando MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Como é necessário um kit comercial para cada amostra, o teste é muito caro para a triagem como parte da triagem neonatal.

Procedimento:

População do estudo Os hospitais na Alemanha são livres de escolher para qual dos 11 laboratórios certificados enviarão os cartões de sangue seco para rastreio neonatal e se pretendem participar em projectos-piloto.

Neste projecto, o laboratório Becker & Kollegen em Munique e o laboratório de rastreio de Hannover estão a informar os seus remetentes sobre a possibilidade de adicionar o rastreio genético para cistinose (Hannover) ou cistinose e SMA (Munique) ao rastreio neonatal rotineiramente estabelecido.

A população do estudo inclui recém-nascidos cujos pais desejam participar do projeto piloto e forneceram consentimento informado por escrito. É fornecida uma informação adicional e uma folha de consentimento para o rastreio de cistinose e SMA, que inclui uma explicação do processo e objectivos de rastreio, benefícios esperados, possíveis consequências adversas da não participação e a importância dos resultados do teste. Os pais são informados de que serão informados sobre resultados normais e normais somente mediante solicitação. O consentimento deve ser documentado com a assinatura de pelo menos um dos pais e a assinatura do médico informador no formulário de consentimento. O formulário de consentimento para o projeto piloto também inclui consentimento para compartilhar informações de contato e resultados com um centro especializado em caso de resultado anormal do exame.

Em caso de resultado positivo, o laboratório deverá primeiro informar o remetente e esclarecer se a criança ainda se encontra ou não internada. Se a criança ainda estiver em tratamento hospitalar, o remetente obtém as informações iniciais dos pais e notifica um especialista para o diagnóstico correspondente. Se a criança já tiver recebido alta hospitalar, o laboratório contacta diretamente o especialista competente (Cistinose: Priv.-Doz. Dr. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Wolfgang Müller-Felber, Munique).

Amostragem A triagem genética molecular é realizada usando o mesmo cartão de sangue seco (gotas de sangue em um cartão de papel filtro) da NBS de rotina. Nenhuma coleta adicional de sangue é necessária. Se houver pouco material disponível, a NBS regular é realizada primeiro, seguida pela triagem para cistinose e AME. De acordo com a diretriz pediátrica, a amostra de sangue para a NBS deve ser coletada entre 36 e 72 horas de vida.

Em geral, para todos os resultados inválidos (ou seja, se a reacção de controlo falhar) e para todos os resultados anormais, o teste é repetido internamente para confirmação utilizando a amostra de sangue disponível. Se a qualidade da amostra de sangue for fraca (por exemplo, muito pouco sangue), o laboratório solicitará uma nova amostra de sangue. Se houver muito pouco material para realizar o sequenciamento de próxima geração necessário, o laboratório também solicitará outra amostra de sangue seco.

Medições e Métodos Cistinose: Para triagem de cistinose, a PCR multiplex foi realizada no primeiro estágio para detectar as três mutações CTNS mais comuns na Alemanha, ou seja, uma deleção de 57kb (responsável por cerca de metade da cistinose na Europa e América do Norte) c.18_21delGACT, p. .T7Ffs*7 e c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Amostras heterozigotas serão submetidas ao sequenciamento de próxima geração baseado em amplicon para 101 mutações patogênicas. Esta abordagem prevê uma taxa de detecção de 96,5%.

SMA A PCR triplex para as mutações CTNS descritas acima é complementada por outra PCR que detecta o éxon 7 no gene SMN1. Com esta PCR quadruplex, um sinal específico é obtido para amostras normais (aquelas sem ou com deleção heterozigótica do éxon 7 em ambos os alelos do gene SMN1). A triagem de SMA é considerada positiva se uma deleção homozigótica do éxon 7 for detectada no gene SMN1. A ausência de amplificação por PCR indica a ausência de uma cópia funcional do SMN1, ou seja, um recém-nascido afetado. Indivíduos heterozigotos não podem ser detectados por este método Taxa de detecção, resultados falsos positivos e falsos negativos Uma taxa global de detecção de mais de 95% é assumida para ambas as doenças. Resultados de triagem falsos negativos são improváveis. Na cistinose, resultados falsos negativos são possíveis devido a mutações raras previamente desconhecidas ou a pacientes que não são portadores de nenhuma das três mutações mais comuns. Na AME, os pacientes nos quais uma deleção heterozigótica é combinada com uma mutação pontual não são considerados. Em pacientes com sintomas de cistinose ou AME, outros testes diagnósticos são realizados independentemente da triagem.

Resultados de triagem falsos positivos também são muito improváveis. Na cistinose, uma amostra heterozigótica pode aparecer falsamente como homozigótica devido ao "abandono alélico" (falha na PCR de um alelo devido a mutações na região de ligação do primer).

Confirmação do diagnóstico Cistinose: Em pacientes com mutação homozigótica ou heterozigótica composta em um gene CTNS, o diagnóstico é confirmado pela determinação do nível de cistina intraleucocítica no sangue com EDTA. Esta amostra é enviada ao laboratório metabólico de Münster nos primeiros 14 dias de vida.

SMA: Se o exon 7 no gene SMN1 for homozigoto, a SMA deve ser assumida (> 50% tipo I com evolução mais grave). Para classificar a gravidade da SMA, são necessários diagnósticos adicionais, registrando o número de cópias do SMN-2. Outra amostra de sangue será enviada pelo centro de atendimento responsável ao laboratório de referência em Ulm. Os resultados dos testes de verificação são encaminhados ao laboratório de triagem para controle de qualidade.

Cuidados com a criança afetada Cistinose: As crianças com resultados positivos no rastreio de cistinose são encaminhadas para o centro de doenças metabólicas mais próximo. A terapia com cisteamina será iniciada imediatamente após a confirmação do diagnóstico.

SMA: As crianças com resultados positivos no rastreio de SMA são encaminhadas para o Centro de Doenças Neuromusculares do Centro Social Pediátrico do Hospital Infantil Dr. von Hauner (Baviera) ou para os Hospitais Universitários de Essen e Münster.

Escopo do projeto O projeto foi inicialmente limitado a 200 mil amostras, com possibilidade de expansão.