Genetyczne badania przesiewowe noworodków w kierunku cystynozy i rdzeniowego zaniku mięśni (GENESIS1)

Populacyjne badania przesiewowe noworodków (NBS) to ważny program zdrowia publicznego, który dzięki wczesnemu wykryciu znacznie poprawił przebieg kilku chorób. Wybór badanych zaburzeń zasadniczo opiera się na 10 zasadach przedstawionych przez Wilsona i Jungnera. W Niemczech NBS jest dobrowolnym programem krajowej służby zdrowia od 1969 roku i obecnie obejmuje 17 schorzeń. Obecne metody NBS, które wykorzystują analizę tandemowej spektrometrii mas wysuszonych plam krwi noworodków, nie są w stanie wykryć wielu potencjalnie uleczalnych schorzeń genetycznych. Jednocześnie molekularne metody NBS są coraz bardziej wykonalne, ponieważ DNA można wyodrębnić z wysuszonej plamki krwi, sekwencjonowanie nowej generacji stało się ekonomiczne, a diagnostyka molekularna jest bardziej wiarygodna i ważniejsza w miarę jak genetyczne bazy danych stają się bardziej udoskonalone i wszechstronne. Cystynoza nefropatyczna i rdzeniowy zanik mięśni (SMA) kwalifikują się do leczenia NBS na podłożu molekularnym, ponieważ dostępne są skuteczne terapie.

Badanie to zapewni podstawę naukową do badań przesiewowych noworodków w kierunku cystynozy i SMA oraz pozwoli sprawdzić, czy powinno się zalecać włączenie tych chorób do ogólnych badań przesiewowych noworodków. Obserwując zidentyfikowane niemowlęta w porównaniu z pacjentami zdiagnozowanymi objawowo poza projektem pilotażowym, ustalimy, czy i w jakim stopniu wczesne rozpoznanie i rozpoczęcie terapii prowadzi do korzystniejszego rokowania.

Cystynoza: Cystynoza jest rzadką, autosomalną recesywną chorobą ogólnoustrojową o wysokiej zachorowalności i śmiertelności, spowodowaną patogennymi wariantami genu CTNS kodującego cystynozynę lizosomalnego transportera cystyny, prowadzącą do gromadzenia się cystyny ​​w lizosomie. Trwająca całe życie terapia zubożająca cystynę doustną cysteaminą, jedyną specyficzną metodą leczenia cystynozy, wraz z dostępnością terapii nerkozastępczej w dzieciństwie, radykalnie poprawiła wyniki leczenia pacjentów. Istnieją mocne dowody na to, że zarówno wczesne rozpoczęcie, jak i długotrwałe leczenie cysteaminą są niezbędne do opóźnienia postępu przewlekłej choroby nerek (CKD) i uszkodzenia narządów końcowych.

Obecnie rozpoznanie cystynozy opiera się na obecności podwyższonego poziomu cystyny ​​w białych krwinkach. Ta metoda nie jest odpowiednia dla NBS.

Rdzeniowy zanik mięśni (SMA): Rdzeniowy zanik mięśni występuje w Niemczech z częstością około 1:10 000 żywych urodzeń. Dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny. Noworodki z rdzeniowym zanikiem mięśni po urodzeniu nie mają objawów klinicznych.

Przyczyną rdzeniowego zaniku mięśni jest delecja eksonu 7 w genie SMN1, genie kodującym „białko neuronu motorycznego przeżycia”. Delecji homozygotycznej brakuje funkcjonalnego białka SMN, od którego zależą komórki rogu przedniego rdzenia kręgowego. Nosiciele heterozygotyczni są bezobjawowi. Brak funkcjonalnego białka SMN powoduje uszkodzenie neuronów ruchowych na poziomie rdzenia kręgowego, prowadząc do ciężkiej przebudowy neurogennej i zaniku mięśni szkieletowych.

Oprócz genu SMN1 ludzie mają prawie identyczny, sąsiadujący z sobą „pseudogen” – gen SMN2. Różni się od genu SMN1 jedynie 5 pojedynczymi parami zasad. Białko SMN2 nie odgrywa żadnej roli u zdrowych ludzi, ponieważ występuje wystarczająca ilość funkcjonalnego białka SMN1. Gen SMN2 zawiera przełącznik molekularny, który może całkowicie wyłączyć ekspresję genu. Kliniczną zmienność rdzeniowego zaniku mięśni wyjaśnia zróżnicowana ekspresja białka SMN2. Zatem odczyt genu SMN2, łącznie z jego eksonem 7, poprzez hamowanie wyłącznika stanowi cel terapeutyczny w leczeniu pacjentów z SMA. Możliwość pozytywnego wpływu terapii na przebieg choroby wykazano w wieloośrodkowym badaniu kontrolowanym placebo z użyciem antysensownego oligonukleotydu nusinersen (Spinraza®) firmy Ionis/Biogen w latach 2015/2016.

Rozpoznanie choroby w przypadku podejrzenia klinicznego stawiano na podstawie celowanych testów genów SMN1 i SMN2 z krwi EDTA i wyizolowanego z niej DNA. Test jest zwykle wykonywany w laboratoriach genetycznych przy użyciu metody MLPA (multipleksowa amplifikacja sondy zależna od ligacji). Ponieważ do każdej próbki wymagany jest dostępny na rynku zestaw, test jest zbyt kosztowny, aby można go było przeprowadzić w ramach badań przesiewowych noworodków.

Procedura:

Badana populacja Szpitale w Niemczech mają swobodę wyboru, do którego z 11 certyfikowanych laboratoriów wysyłają karty suchej krwi w celu badań przesiewowych noworodków oraz czy chcą uczestniczyć w projektach pilotażowych.

W ramach tego projektu laboratorium Becker & Kollegen w Monachium oraz laboratorium przesiewowe w Hanowerze informują swoich nadawców o możliwości dodania badań przesiewowych genetycznych w kierunku cystynozy (Hannover) lub cystynozy i SMA (Monachium) do rutynowych badań przesiewowych noworodków.

Badaną populację stanowią noworodki, których rodzice wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w projekcie pilotażowym. Dostarczona jest dodatkowa informacja i arkusz zgody na badania przesiewowe w kierunku cystynozy i SMA, który zawiera wyjaśnienie procesu i celów badań przesiewowych, oczekiwanych korzyści, możliwych niekorzystnych konsekwencji nieuczestniczenia oraz znaczenie wyników badania. Informuje się rodziców, że o normalnych, niczym nie wyróżniających się wynikach zostaną poinformowani wyłącznie na żądanie. Zgoda musi być udokumentowana podpisem przynajmniej jednego z rodziców oraz podpisem lekarza zgłaszającego na formularzu zgody. Formularz zgody na projekt pilotażowy zawiera także zgodę na udostępnienie danych kontaktowych i ustaleń specjalistycznemu ośrodku w przypadku nieprawidłowego wyniku badania przesiewowego.

W przypadku wyniku pozytywnego laboratorium musi najpierw poinformować nadawcę i wyjaśnić, czy dziecko nadal przebywa w szpitalu. Jeżeli dziecko nadal znajduje się w leczeniu szpitalnym, nadawca uzyskuje wstępne informacje od rodziców i powiadamia biegłego w celu postawienia odpowiedniej diagnozy. Jeżeli dziecko zostało już wypisane ze szpitala, laboratorium kontaktuje się bezpośrednio z właściwym specjalistą (Cystinosis: Priv.-Doz. dr med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: prof. dr n. med. Wolfganga Müllera-Felbera, Monachium).

Pobieranie próbek Molekularne badania przesiewowe przeprowadza się przy użyciu tej samej karty suchej krwi (krople krwi na bibule filtracyjnej), co rutynowe badanie NBS. Nie jest wymagane dodatkowe pobieranie krwi. Jeśli dostępna jest niewielka ilość materiału, w pierwszej kolejności wykonuje się zwykłe badanie NBS, a następnie badania przesiewowe w kierunku cystynozy i SMA. Zgodnie z wytycznymi pediatrycznymi próbkę krwi do NBS należy pobierać pomiędzy 36 a 72 godziną życia.

Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku wszystkich nieważnych wyników (tj. jeśli reakcja kontrolna nie powiedzie się) i wszystkich nieprawidłowych wyników, test jest powtarzany wewnętrznie w celu potwierdzenia przy użyciu dostępnej próbki krwi. Jeżeli jakość próbki krwi jest niska (np. jest jej za mało), laboratorium poprosi o pobranie nowej próbki krwi. Jeżeli materiału jest zbyt mało, aby przeprowadzić wymagane sekwencjonowanie nowej generacji, laboratorium poprosi również o kolejną próbkę suszonej krwi.

Pomiary i metody Cystynoza: W przypadku badań przesiewowych w kierunku cystynozy na pierwszym etapie przeprowadzono multipleksową PCR w celu wykrycia trzech najczęstszych mutacji CTNS w Niemczech, tj. delecji 57 kb (odpowiedzialnej za około połowę cystynozy w Europie i Ameryce Północnej) c.18_21delGACT, str. .T7Ffs*7 i c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Próbki heterozygotyczne zostaną poddane sekwencjonowaniu nowej generacji w oparciu o amplikon pod kątem 101 mutacji patogennych. Podejście to przewiduje współczynnik wykrywalności na poziomie 96,5%.

SMA Opisany powyżej potrójny PCR dla mutacji CTNS jest uzupełniany innym PCR, który wykrywa ekson 7 w genie SMN1. Za pomocą tej poczwórnej reakcji PCR uzyskuje się specyficzny sygnał dla normalnych próbek (tych bez lub z heterozygotyczną delecją eksonu 7 w obu allelach genu SMN1). Badanie przesiewowe w kierunku SMA uznaje się za pozytywne, jeśli w genie SMN1 wykryta zostanie homozygotyczna delecja eksonu 7. Brak amplifikacji PCR wskazuje na brak funkcjonalnej kopii SMN1, tj. chorego noworodka. Metodą tą nie można wykryć osobników heterozygotycznych. Wskaźnik wykrywalności, wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne. W przypadku obu chorób zakłada się, że ogólny wskaźnik wykrywalności wynosi ponad 95%. Fałszywie negatywne wyniki badań przesiewowych są mało prawdopodobne. W przypadku cystynozy możliwe są wyniki fałszywie ujemne ze względu na nieznane wcześniej rzadkie mutacje lub pacjentów niebędących nosicielami żadnej z trzech najczęstszych mutacji. W przypadku SMA nie uwzględnia się pacjentów, u których heterozygotyczna delecja jest połączona z mutacją punktową. U pacjentów z objawami cystynozy lub SMA dalsze badania diagnostyczne wykonuje się niezależnie od badań przesiewowych.

Fałszywie pozytywne wyniki badań przesiewowych są również bardzo mało prawdopodobne. W cystynozie próbka heterozygotyczna może fałszywie wydawać się homozygotyczna z powodu „porzucenia alleli” (niepowodzenie PCR allelu z powodu mutacji w regionie wiązania startera).

Potwierdzenie rozpoznania Cystynoza: U pacjentów, u których stwierdzono homozygotyczną lub złożoną heterozygotyczną mutację w genie CTNS, rozpoznanie potwierdza się poprzez oznaczenie poziomu cystyny ​​wewnątrzleukocytowej w krwi EDTA. Próbka ta jest wysyłana do laboratorium metabolicznego w Münster w ciągu pierwszych 14 dni życia.

SMA: Jeśli ekson 7 genu SMN1 jest homozygotyczny, należy założyć SMA (> 50% typu I z najcięższym przebiegiem). W celu klasyfikacji ciężkości SMA konieczna jest dalsza diagnostyka poprzez rejestrację liczby kopii SMN-2. Kolejna próbka krwi zostanie wysłana przez ośrodek odpowiedzialny za opiekę do laboratorium referencyjnego w Ulm. Wyniki badań weryfikacyjnych przekazywane są do laboratorium przesiewowego w celu kontroli jakości.

Opieka nad chorym dzieckiem Cystynoza: Dzieci z pozytywnymi wynikami badań przesiewowych w kierunku cystynozy kierowane są do najbliższego ośrodka chorób metabolicznych. Terapia cysteaminą zostanie rozpoczęta niezwłocznie po potwierdzeniu diagnozy.

SMA: Dzieci z pozytywnymi wynikami badań przesiewowych w kierunku SMA kierowane są do Centrum Chorób Nerwowo-Mięśniowych w Społecznym Centrum Pediatrycznym Szpitala Dziecięcego Dr. von Hauner (Bawaria) lub do Szpitali Uniwersyteckich w Essen i Münster.

Zakres projektu Projekt początkowo ograniczał się do 200 000 próbek, z możliwością rozbudowy.