Genetische screening van pasgeborenen op cystinose en spinale spieratrofie (GENESIS1)

Populatiegebaseerde screening van pasgeborenen (NBS) is een belangrijk volksgezondheidsprogramma dat door vroege detectie het beloop van verschillende ziekten enorm heeft verbeterd. De selectie van gescreende stoornissen volgt over het algemeen de tien principes die zijn uiteengezet door Wilson en Jungner. In Duitsland is NBS sinds 1969 een vrijwillig National Health Service-programma dat momenteel 17 aandoeningen omvat. De huidige NBS-methoden, die gebruik maken van tandem-massaspectrometrische analyse van opgedroogde bloedvlekken bij pasgeborenen, kunnen veel potentieel behandelbare genetische aandoeningen niet detecteren. Tegelijkertijd wordt NBS op moleculaire basis steeds beter haalbaar omdat DNA kan worden geëxtraheerd uit een gedroogde bloedvlek, sequencing van de volgende generatie economisch is geworden en moleculaire diagnostiek een grotere betrouwbaarheid en grotere validiteit heeft naarmate genetische databases verfijnder en uitgebreider worden. Nefropathische cystinose en spinale musculaire atrofie (SMA) komen in aanmerking voor moleculair gebaseerde NBS omdat er effectieve therapieën beschikbaar zijn.

Deze studie zal een wetenschappelijke basis bieden voor de screening van pasgeborenen op cystinose en SMA en onderzoeken of opname van deze ziekten in de algemene screening van pasgeborenen aanbevolen zou moeten worden. Door geïdentificeerde baby's te vergelijken met symptomatisch gediagnosticeerde patiënten buiten het pilotproject, zullen we bepalen of en in welke mate vroege diagnose en start van therapie tot een gunstiger prognose leiden.

Cystinose: Cystinose is een zeldzame autosomaal recessieve systemische ziekte met hoge morbiditeit en mortaliteit, veroorzaakt door pathogene varianten in het CTNS-gen dat codeert voor de lysosomale cystinetransporter cystinosine, wat leidt tot accumulatie van cystine in het lysosoom. Levenslange cystine-uitputtende therapie met orale cysteamine, de enige specifieke therapie voor cystinose, heeft, samen met de beschikbaarheid van nierfunctievervangende therapie in de kindertijd, de uitkomsten voor de patiënt dramatisch verbeterd. Er is robuust bewijs dat vroege start en aanhoudende therapie met cysteamine beide essentieel zijn voor het vertragen van de progressie naar chronische nierziekte (CKD) en eindorgaanschade.

Momenteel is de diagnose van cystinose gebaseerd op de aanwezigheid van verhoogde cystinewaarden in witte bloedcellen. Deze methode is niet geschikt voor NBS.

Spinale musculaire atrofie (SMA): Spinale musculaire atrofie komt in Duitsland voor bij ongeveer 1:10.000 levendgeborenen. Het wordt op autosomaal recessieve wijze overgeërfd. Pasgeborenen met spinale spieratrofie hebben na de geboorte geen klinische symptomen.

De oorzaak van spinale spieratrofie is een deletie van exon 7 in het SMN1-gen, het coderende gen voor het "overlevingsmotorneuroneiwit". Homozygote deletie mist het functionele SMN-eiwit waarvan de voorhoorncellen in het ruggenmerg afhankelijk zijn. Heterozygote dragers zijn asymptomatisch. Het ontbreken van het functionele SMN-eiwit resulteert in schade aan motorneuronen op het niveau van het ruggenmerg, wat leidt tot ernstige neurogene hermodellering en atrofie van skeletspieren.

Naast het SMN1-gen hebben mensen een vrijwel identiek, naastgelegen ‘pseudo-gen’, het SMN2-gen. Het verschilt slechts van het SMN1-gen door 5 enkele basenparen. Bij gezonde mensen speelt het SMN2-eiwit geen rol, omdat er voldoende functioneel SMN1-eiwit aanwezig is. Het SMN2-gen bevat een moleculaire schakelaar die de expressie van het gen volledig kan uitschakelen. De klinische variabiliteit van spinale musculaire atrofie wordt verklaard door differentiële expressie van het SMN2-eiwit. Het uitlezen van het SMN2-gen inclusief zijn exon 7 door remming van de uit-schakelaar vertegenwoordigt dus een therapeutisch doelwit voor de behandeling van SMA-patiënten. De mogelijkheid van een therapie om het beloop van de ziekte positief te beïnvloeden werd aangetoond in de placebogecontroleerde multicentrische studie met een antisense oligonucleotide nusinersen (Spinraza®) van Ionis/Biogen in 2015/2016.

De diagnose van de ziekte in gevallen van klinische verdenking is gesteld door gericht testen van de SMN1- en SMN2-genen uit EDTA-bloed en daaruit geïsoleerd DNA. De test wordt meestal uitgevoerd in genetische laboratoria met behulp van MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Omdat voor elk monster een commerciële kit nodig is, is de test te duur voor screening als onderdeel van de screening van pasgeborenen.

Procedure:

Onderzoekspopulatie Ziekenhuizen in Duitsland zijn vrij om te kiezen naar welke van de 11 gecertificeerde laboratoria zij de drogebloedspotkaarten sturen voor de screening van pasgeborenen en of zij willen deelnemen aan pilotprojecten.

In dit project informeren het laboratorium van Becker & Kollegen in München en het screeningslaboratorium van Hannover hun afzenders over de mogelijkheid om genetische screening op cystinose (Hannover) of cystinose en SMA (München) toe te voegen aan de routinematig vastgestelde screening van pasgeborenen.

De onderzoekspopulatie omvat pasgeborenen waarvan de ouders willen deelnemen aan het proefproject en schriftelijke geïnformeerde toestemming hebben gegeven. Er wordt een aanvullend informatie- en toestemmingsblad voor cystinose- en SMA-screening verstrekt, met daarin een uitleg van het screeningproces en de doelstellingen, de verwachte voordelen, mogelijke nadelige gevolgen van niet-deelname en de betekenis van de testresultaten. Ouders worden geïnformeerd dat zij alleen op verzoek op de hoogte worden gesteld van normale, onopvallende resultaten. De toestemming moet worden gedocumenteerd met de handtekening van ten minste één ouder en de handtekening van de informerende arts op het toestemmingsformulier. In het toestemmingsformulier voor het pilotproject is tevens toestemming opgenomen voor het delen van contactgegevens en bevindingen met een gespecialiseerd centrum in geval van een afwijkende screeningsuitslag.

Bij een positieve uitslag moet het laboratorium eerst de afzender informeren en verduidelijken of het kind nog in het ziekenhuis ligt. Als het kind nog intramuraal wordt behandeld, krijgt de afzender de eerste informatie van de ouders en brengt hij een deskundige op de hoogte voor de bijbehorende diagnose. Als het kind al uit het ziekenhuis is ontslagen, neemt het laboratorium rechtstreeks contact op met de juiste deskundige (Cystinose: Priv.-Doz. Dr. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, München).

Bemonstering Moleculair genetische screening wordt uitgevoerd met behulp van dezelfde droogbloedkaart (druppels bloed op een filtreerpapierkaart) als routinematige NBS. Er is geen extra bloedafname nodig. Als er weinig materiaal beschikbaar is, wordt eerst de reguliere NBS uitgevoerd, gevolgd door screening op cystinose en SMA. Volgens de kinderrichtlijn moet het bloedmonster voor de NBS tussen de 36 en 72 levensuren worden afgenomen.

In het algemeen wordt voor alle ongeldige resultaten (d.w.z. als de controlereactie mislukt) en voor alle abnormale resultaten de test ter bevestiging intern herhaald met behulp van het beschikbare bloedmonster. Als de kwaliteit van het bloedmonster slecht is (bijvoorbeeld te weinig bloed), zal het laboratorium een ​​nieuw bloedmonster aanvragen. Als er te weinig materiaal is om de benodigde next-generation sequencing uit te voeren, zal het laboratorium ook nog eens een gedroogd bloedmonster aanvragen.

Metingen en methoden Cystinose: Voor screening op cystinose werd in de eerste fase multiplex PCR uitgevoerd om de drie meest voorkomende CTNS-mutaties in Duitsland te detecteren, namelijk een deletie van 57 kb (verantwoordelijk voor ongeveer de helft van de cystinose in Europa en Noord-Amerika) c.18_21delGACT, p .T7Ffs*7 en c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Heterozygote monsters zullen worden onderworpen aan op amplicon gebaseerde next-generation sequencing voor 101 pathogene mutaties. Deze aanpak voorspelt een detectiepercentage van 96,5%.

SMA De triplex PCR voor de hierboven beschreven CTNS-mutaties wordt aangevuld met een andere PCR die exon 7 in het SMN1-gen detecteert. Met deze quadruplex PCR wordt een specifiek signaal verkregen voor normale monsters (die zonder of met heterozygote exon 7-deletie in beide allelen van het SMN1-gen). SMA-screening wordt als positief beschouwd als een homozygote exon 7-deletie wordt gedetecteerd in het SMN1-gen. De afwezigheid van PCR-amplificatie duidt op de afwezigheid van een functionele SMN1-kopie, dat wil zeggen een getroffen pasgeborene. Heterozygote individuen kunnen met deze methode niet worden opgespoord. Detectiepercentage, fout-positieve en fout-negatieve resultaten Voor beide ziekten wordt uitgegaan van een totaal detectiepercentage van meer dan 95%. Vals-negatieve screeningresultaten zijn onwaarschijnlijk. Bij cystinose zijn vals-negatieve resultaten mogelijk als gevolg van voorheen onbekende zeldzame mutaties of patiënten die geen van de drie meest voorkomende mutaties dragen. Bij SMA worden patiënten waarbij een heterozygote deletie gecombineerd is met een puntmutatie buiten beschouwing gelaten. Bij patiënten met symptomen van cystinose of SMA worden verdere diagnostische tests uitgevoerd, onafhankelijk van de screening.

Vals-positieve screeningresultaten zijn ook zeer onwaarschijnlijk. Bij cystinose kan een heterozygoot monster ten onrechte homozygoot lijken vanwege "allelische drop-out" (PCR-falen van een allel als gevolg van mutaties in het primerbindende gebied).

Bevestiging van de diagnose Cystinose: Bij patiënten bij wie een homozygote of samengestelde heterozygote mutatie in een CTNS-gen is vastgesteld, wordt de diagnose bevestigd door het bepalen van de intraleukocytische cystinespiegel uit EDTA-bloed. Dit monster wordt binnen de eerste 14 levensdagen naar het metabolische laboratorium in Münster gestuurd.

SMA: Als exon 7 in het SMN1-gen homozygoot is, moet worden uitgegaan van SMA (> 50% type I met het ernstigste beloop). Om de ernst van SMA te classificeren is verdere diagnostiek vereist door het aantal SMN-2-kopieën te registreren. Een ander bloedmonster wordt door het verantwoordelijke zorgcentrum naar het referentielaboratorium in Ulm gestuurd. De verificatietestresultaten worden voor kwaliteitscontrole doorgestuurd naar het screeningslaboratorium.

Zorg voor het getroffen kind Cystinose: Kinderen met positieve screeningsresultaten voor cystinose worden doorverwezen naar het dichtstbijzijnde centrum voor stofwisselingsziekten. De behandeling met cysteamine wordt onmiddellijk gestart nadat de diagnose is bevestigd.

SMA: Kinderen met positieve SMA-screeningsresultaten worden verwezen naar het Centrum voor Neuromusculaire Ziekten in het Sociaal Pediatrisch Centrum van het Dr. von Hauner Kinderziekenhuis (Beieren) of naar de Universitaire Ziekenhuizen van Essen en Münster.

Projectomvang Het project was aanvankelijk beperkt tot 200.000 monsters, met mogelijkheid tot uitbreiding.