Генетический скрининг новорожденных на цистиноз и спинальную мышечную атрофию (GENESIS1)

Популяционный скрининг новорожденных (NBS) является важной программой общественного здравоохранения, которая значительно улучшила течение ряда заболеваний благодаря раннему выявлению. Выбор заболеваний, подлежащих скринингу, обычно следует 10 принципам, изложенным Уилсоном и Юнгнером. В Германии NBS является добровольной программой Национальной службы здравоохранения с 1969 года, которая в настоящее время охватывает 17 заболеваний. Современные методы NBS, в которых используется тандемный масс-спектрометрический анализ засохших пятен крови новорожденных, не могут обнаружить многие потенциально излечимые генетические заболевания. В то же время NBS на молекулярной основе становится все более осуществимой, поскольку ДНК можно извлечь из высохшего пятна крови, секвенирование следующего поколения стало экономичным, а молекулярная диагностика становится более надежной и достоверной, поскольку генетические базы данных становятся более точными и полными. Нефропатический цистиноз и спинальная мышечная атрофия (СМА) подходят для применения NBS на молекулярной основе, поскольку доступны эффективные методы лечения.

Это исследование обеспечит научную основу для скрининга новорожденных на цистиноз и СМА и выяснит, следует ли рекомендовать включение этих заболеваний в общий скрининг новорожденных. Наблюдая за идентифицированными младенцами по сравнению с пациентами с симптоматическим диагнозом вне пилотного проекта, мы определим, приводит ли ранняя диагностика и начало терапии к более благоприятному прогнозу и если да, то в какой степени.

Цистиноз: Цистиноз — редкое аутосомно-рецессивное системное заболевание с высокой заболеваемостью и смертностью, вызванное патогенными вариантами гена CTNS, который кодирует лизосомальный транспортер цистина цистинозин, что приводит к накоплению цистина в лизосомах. Пожизненная цистинистощающая терапия пероральным цистеамином, единственным специфическим методом лечения цистиноза, наряду с доступностью заместительной почечной терапии в детстве, значительно улучшила результаты лечения пациентов. Имеются убедительные доказательства того, что раннее начало и продолжительная терапия цистеамином необходимы для замедления прогрессирования хронической болезни почек (ХБП) и повреждения органов-мишеней.

В настоящее время диагноз цистиноза основывается на наличии повышенного уровня цистина в лейкоцитах. Этот метод не подходит для НБС.

Спинальная мышечная атрофия (СМА). Распространенность спинальной мышечной атрофии в Германии составляет примерно 1:10 000 живорождений. Наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Новорожденные со спинальной мышечной атрофией после рождения не имеют клинических симптомов.

Причиной спинальной мышечной атрофии является делеция экзона 7 в гене SMN1, кодирующем ген «белка выживания двигательных нейронов». В гомозиготной делеции отсутствует функциональный белок SMN, от которого зависят клетки переднего рога спинного мозга. Гетерозиготные носители протекают бессимптомно. Отсутствие функционального белка SMN приводит к повреждению мотонейронов на уровне спинного мозга, что приводит к тяжелому нейрогенному ремоделированию и атрофии скелетных мышц.

Помимо гена SMN1, у людей есть почти идентичный, расположенный рядом «псевдоген» — ген SMN2. Он отличается от гена SMN1 всего пятью отдельными парами оснований. Белок SMN2 не играет никакой роли у здоровых людей, поскольку присутствует достаточно функциональный белок SMN1. Ген SMN2 содержит молекулярный переключатель, который может полностью остановить экспрессию гена. Клиническая вариабельность спинальной мышечной атрофии объясняется дифференциальной экспрессией белка SMN2. Таким образом, считывание гена SMN2, включая его экзон 7, путем ингибирования выключателя представляет собой терапевтическую мишень для лечения пациентов со СМА. Возможность терапии положительно влиять на течение заболевания была продемонстрирована в плацебо-контролируемом многоцентровом исследовании с использованием антисмыслового олигонуклеотида нусинерсена (Спинраза®) компании Ionis/Biogen в 2015/2016 г.

Диагностика заболевания при клиническом подозрении осуществляется путем целенаправленного тестирования генов SMN1 и SMN2 из крови с ЭДТА и выделенной из нее ДНК. Тест обычно проводится в генетических лабораториях с использованием MLPA (мультиплексная амплификация зонда, зависящая от лигирования). Поскольку для каждого образца требуется коммерческий набор, тест слишком дорог для скрининга в рамках скрининга новорожденных.

Процедура:

Исследуемая популяция Больницы в Германии могут свободно выбирать, в какую из 11 сертифицированных лабораторий отправлять карты сухих пятен крови для скрининга новорожденных и хотят ли они участвовать в пилотных проектах.

В рамках этого проекта лаборатория Becker & Kollegen в Мюнхене и скрининговая лаборатория Ганновера информируют своих отправителей о возможности добавления генетического скрининга на цистиноз (Ганновер) или цистиноза и СМА (Мюнхен) к рутинному скринингу новорожденных.

В исследуемую популяцию входят новорожденные, родители которых желают участвовать в пилотном проекте и предоставили письменное информированное согласие. Предоставляется дополнительная информация и лист согласия на скрининг на цистиноз и СМА, который включает объяснение процесса и целей скрининга, ожидаемых преимуществ, возможных неблагоприятных последствий неучастия, а также значимости результатов теста. Родители проинформированы о том, что о нормальных, ничем не примечательных результатах они будут проинформированы только по запросу. Согласие должно быть подтверждено подписью хотя бы одного родителя и подписью врача-информатора на форме согласия. Форма согласия на пилотный проект также включает согласие на передачу контактной информации и результатов анализа специализированному центру в случае аномального результата скрининга.

В случае положительного результата лаборатория должна сначала проинформировать отправителя и уточнить, находится ли ребенок еще в больнице. Если ребенок еще находится на стационарном лечении, отправитель получает исходную информацию от родителей и сообщает специалисту для постановки соответствующего диагноза. Если ребенок уже выписан из стационара, лаборатория обращается непосредственно к соответствующему специалисту (Цистиноз: Прив.-Доз. Доктор мед. Катарина Хоэнфелльнер, Розенхайм; СМА: Профессор, доктор медицинских наук. Вольфганг Мюллер-Фельбер, Мюнхен).

Отбор проб Молекулярно-генетический скрининг проводится с использованием той же карты сухой крови (капли крови на карточке из фильтровальной бумаги), что и при обычном NBS. Никакого дополнительного забора крови не требуется. Если материала мало, сначала проводят обычный NBS, а затем скрининг на цистиноз и СМА. Согласно педиатрическим рекомендациям, образец крови на NBS следует брать в период от 36 до 72 часов жизни.

Как правило, для всех недействительных результатов (т. е. если контрольная реакция не удалась) и для всех аномальных результатов тест повторяется внутри компании для подтверждения с использованием имеющегося образца крови. Если качество образца крови плохое (например, слишком мало крови), лаборатория запросит новый образец крови. Если материала слишком мало для выполнения необходимого секвенирования следующего поколения, лаборатория также запросит еще один образец сухой крови.

Измерения и методы. Цистиноз: для скрининга цистиноза на первом этапе была проведена мультиплексная ПЦР для выявления трех наиболее распространенных мутаций CTNS в Германии, т.е. делеции 57 т.п.н. (ответственной примерно за половину цистинозов в Европе и Северной Америке) c.18_21delGACT, p .T7Ffs*7 и c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Гетерозиготные образцы будут подвергнуты секвенированию следующего поколения на основе ампликонов на предмет 101 патогенной мутации. Этот подход прогнозирует уровень обнаружения 96,5%.

SMA Триплекс-ПЦР на мутации CTNS, описанные выше, дополняется другим ПЦР, который обнаруживает экзон 7 в гене SMN1. С помощью этой квадруплексной ПЦР специфический сигнал получается для нормальных образцов (без или с гетерозиготной делецией экзона 7 в обоих аллелях гена SMN1). Скрининг SMA считается положительным, если в гене SMN1 обнаруживается гомозиготная делеция экзона 7. Отсутствие ПЦР-амплификации указывает на отсутствие функциональной копии SMN1, т. е. у пораженного новорожденного. Гетерозиготные особи не могут быть выявлены этим методом. Уровень выявления, ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Предполагается, что общий уровень выявления для обоих заболеваний составляет более 95%. Ложноотрицательные результаты скрининга маловероятны. При цистинозе возможны ложноотрицательные результаты из-за ранее неизвестных редких мутаций или отсутствия у пациентов ни одной из трех наиболее распространенных мутаций. При СМА не учитываются пациенты, у которых гетерозиготная делеция сочетается с точечной мутацией. У пациентов с симптомами цистиноза или СМА дальнейшие диагностические исследования проводятся независимо от скрининга.

Ложноположительные результаты скрининга также очень маловероятны. При цистинозе гетерозиготный образец может ошибочно выглядеть как гомозиготный из-за «выпадения аллеля» (неудачная ПЦР аллеля из-за мутаций в области связывания праймера).

Подтверждение диагноза Цистиноз: у пациентов с гомозиготной или компаунд-гетерозиготной мутацией в гене CTNS диагноз подтверждается путем определения внутрилейкоцитарного уровня цистина в крови с ЭДТА. Этот образец отправляется в метаболическую лабораторию в Мюнстере в течение первых 14 дней жизни.

СМА: Если экзон 7 гена SMN1 гомозиготен, следует предположить СМА (> 50% тип I с наиболее тяжелым течением). Для классификации степени тяжести СМА необходима дальнейшая диагностика путем регистрации количества копий SMN-2. Еще один образец крови будет отправлен ответственным медицинским центром в справочную лабораторию в Ульме. Результаты проверочных испытаний передаются в скрининговую лабораторию для контроля качества.

Уход за больным ребенком Цистиноз: Детей с положительными результатами скрининга на цистиноз направляют в ближайший центр метаболических заболеваний. Терапию цистеамином начинают сразу после подтверждения диагноза.

СМА: Дети с положительными результатами скрининга на СМА направляются либо в Центр нервно-мышечных заболеваний Социально-педиатрического центра детской больницы доктора фон Хаунера (Бавария), либо в университетские больницы Эссена и Мюнстера.

Объем проекта Первоначально проект был ограничен 200 000 образцов с возможностью расширения.