시스틴증 및 척수 근육 위축에 대한 유전적 신생아 선별검사 (GENESIS1)

인구 기반 신생아 선별검사(NBS)는 조기 발견을 통해 여러 질병의 경과를 크게 개선한 중요한 공중 보건 프로그램입니다. 선별된 장애의 선택은 일반적으로 Wilson과 Jungner가 설명한 10가지 원칙을 따릅니다. 독일에서 NBS는 1969년부터 자발적인 국가 보건 서비스 프로그램으로 현재 17개 장애를 다루고 있습니다. 신생아 건조 혈액 반점에 대한 직렬 질량 분광 분석을 사용하는 현재 NBS 방법은 잠재적으로 치료 가능한 많은 유전적 상태를 감지할 수 없습니다. 동시에, 분자 기반 NBS는 건조된 혈액 반점에서 DNA를 추출할 수 있고, 차세대 시퀀싱이 경제적이며, 유전자 데이터베이스가 더욱 정교하고 포괄적이 됨에 따라 분자 진단의 신뢰성과 타당성이 높아졌기 때문에 점점 더 실현 가능성이 높아지고 있습니다. 신장병성 시스틴증 및 척수성 근위축증(SMA)은 효과적인 치료법이 가능하므로 분자 기반 NBS에 적합합니다.

이 연구는 시스틴증 및 SMA에 대한 신생아 선별검사에 대한 과학적 기초를 제공하고 이러한 질병을 일반 신생아 선별검사에 포함시켜야 하는지 여부를 조사할 것입니다. 파일럿 프로젝트 외부에서 증상이 있는 것으로 진단된 환자와 비교하여 확인된 영아를 관찰함으로써 조기 진단 및 치료 시작이 더 유리한 예후로 이어지는지 여부와 어느 정도까지 판단할 것입니다.

시스틴증: 시스틴증은 리소좀 시스틴 운반체 시스티노신을 코딩하는 CTNS 유전자의 병원성 변이로 인해 발생하는 이환율과 사망률이 높은 희귀한 상염색체 열성 전신 질환으로, 이로 인해 리소좀 내에 시스틴이 축적됩니다. 시스틴증에 대한 유일한 특정 치료법인 경구 시스테아민을 이용한 평생 시스틴 고갈 요법과 소아기 신대체 요법의 이용 가능성은 환자 결과를 극적으로 향상시켰습니다. 시스테아민을 이용한 조기 개시와 지속적인 치료가 만성 신장 질환(CKD)과 말단 기관 손상으로의 진행을 지연시키는 데 필수적이라는 강력한 증거가 있습니다.

현재 시스틴증의 진단은 백혈구의 시스틴 수치 상승에 근거합니다. 이 방법은 NBS에는 적합하지 않습니다.

척수근위축증(SMA): 척수근위축증은 독일에서 대략 1:10,000의 출생아의 유병률을 나타냅니다. 상염색체 열성 방식으로 유전됩니다. 척수성 근위축이 있는 신생아는 출생 후 임상 증상이 없습니다.

척수성 근위축증의 원인은 '생존 운동 뉴런 단백질'을 코딩하는 유전자인 SMN1 유전자의 엑손 7이 결실된 것입니다. 동형접합성 결실에는 척수의 전각세포가 의존하는 기능성 SMN 단백질이 부족합니다. 이형접합성 보인자는 증상이 없습니다. 기능성 SMN 단백질이 부족하면 척수 수준의 운동 뉴런이 손상되어 심각한 신경성 리모델링과 골격근 위축이 발생합니다.

인간에게는 SMN1 유전자 외에도 거의 동일한 "유사 유전자"인 SMN2 유전자가 인접해 있습니다. SMN1 유전자와는 5개의 단일 염기쌍만 다릅니다. 충분한 기능성 SMN1 단백질이 존재하기 때문에 SMN2 단백질은 건강한 인간에게는 아무런 역할을 하지 않습니다. SMN2 유전자에는 유전자 발현을 완전히 차단할 수 있는 분자 스위치가 포함되어 있습니다. 척수성 근위축의 임상적 다양성은 SMN2 단백질의 차별적인 발현으로 설명됩니다. 따라서, 오프 스위치의 억제에 의한 엑손 7을 포함하는 SMN2 유전자의 판독은 SMA 환자 치료를 위한 치료 표적을 나타낸다. 질병 경과에 긍정적인 영향을 미치는 치료법의 가능성은 2015/2016년 Ionis/Biogen의 안티센스 올리고뉴클레오티드 누시네르센(Spinraza®)을 사용한 위약 대조 다기관 연구에서 입증되었습니다.

임상적으로 의심되는 경우 질병의 진단은 EDTA 혈액에서 SMN1 및 SMN2 유전자와 그로부터 분리된 DNA를 표적 검사하여 이루어졌습니다. 이 테스트는 일반적으로 MLPA(다중 결찰 의존형 프로브 증폭)를 사용하여 유전학 실험실에서 수행됩니다. 각 검체마다 상용 키트가 필요하기 때문에 신생아 선별검사의 일부로 선별하기에는 검사 비용이 너무 많이 듭니다.

절차:

연구 인구 독일의 병원은 11개의 인증된 실험실 중 신생아 검사를 위해 건조 혈액 검사 카드를 보낼 곳과 파일럿 프로젝트에 참여할지 여부를 자유롭게 선택할 수 있습니다.

이 프로젝트에서 뮌헨의 Becker & Kollegen 연구소와 하노버 선별 연구소는 정기적으로 확립된 신생아 선별 검사에 시스틴증(하노버) 또는 시스틴증 및 SMA(뮌헨)에 대한 유전자 선별 검사를 추가할 가능성에 대해 발신자에게 알리고 있습니다.

연구 모집단에는 부모가 파일럿 프로젝트에 참여하기를 원하고 서면 동의서를 제공한 신생아가 포함됩니다. 시스틴증 및 SMA 검사에 대한 추가 정보 및 동의서가 제공되며, 여기에는 검사 과정 및 목적, 예상되는 이점, 비참여로 인한 부작용 및 검사 결과의 중요성에 대한 설명이 포함됩니다. 부모는 요청이 있는 경우에만 정상적이고 눈에 띄지 않는 결과를 통보받을 것임을 통보받습니다. 동의서는 최소한 한 명의 부모의 서명과 동의서에 정보를 제공한 의사의 서명과 함께 문서화되어야 합니다. 시범사업 동의서에는 심사 결과 이상 발생 시 전문센터와 연락처 및 조사 결과를 공유하는 데 동의하는 내용도 포함됐다.

양성 결과가 나온 경우, 검사실은 먼저 보낸 사람에게 이를 알리고 해당 아동이 아직 병원에 있는지 여부를 명확히 해야 합니다. 아동이 아직 입원 치료를 받고 있는 경우, 발신인은 부모로부터 초기 정보를 입수하고 해당 진단에 대해 전문가에게 통보합니다. 아이가 이미 병원에서 퇴원한 경우, 검사실에서는 해당 전문가에게 직접 연락합니다(Cystinosis: Priv.-Doz. 박사.의대. 카타리나 호헨펠너, 로젠하임; SMA: 교수 Dr. med. 볼프강 뮐러-펠버, 뮌헨).

샘플링 분자 유전학적 검사는 일반 NBS와 동일한 건조 혈액 카드(여과지 카드에 있는 혈액 방울)를 사용하여 수행됩니다. 추가 혈액 수집은 필요하지 않습니다. 자료가 거의 없는 경우 일반 NBS를 먼저 수행한 후 시스틴증 및 SMA에 대한 선별검사를 수행합니다. 소아과 지침에 따르면 NBS용 혈액 샘플은 생후 36~72시간 사이에 채취해야 합니다.

일반적으로 유효하지 않은 모든 결과(예: 대조 반응이 실패한 경우)와 모든 비정상적인 결과에 대해 확인을 위해 사용 가능한 혈액 샘플을 사용하여 내부적으로 테스트를 반복합니다. 혈액 샘플의 품질이 좋지 않은 경우(예: 혈액량이 너무 적은 경우) 검사실에서는 새로운 혈액 샘플을 요청할 것입니다. 필요한 차세대 염기서열분석을 수행하기에 물질이 너무 적은 경우, 실험실에서는 또 다른 건조 혈액 샘플을 요청할 것입니다.

측정 및 방법 시스틴증: 시스틴증 스크리닝을 위해 다중 PCR을 첫 번째 단계에서 수행하여 독일에서 가장 흔한 세 가지 CTNS 돌연변이, 즉 57kb 결실(유럽과 ​​북미에서 시스틴증의 약 절반을 담당)을 검출했습니다. c.18_21delGACT, p .T7Ffs*7 및 c.926dupG, p.S310Qfs*55 . 이형접합성 샘플은 101개 병원성 돌연변이에 대한 앰플리콘 기반 차세대 시퀀싱을 받게 됩니다. 이 접근법은 96.5%의 탐지율을 예측합니다.

SMA 위에서 설명한 CTNS 돌연변이에 대한 삼중 PCR은 SMN1 유전자의 엑손 7을 검출하는 또 다른 PCR로 보완됩니다. 이 4중 PCR을 사용하면 정상 샘플(SMN1 유전자의 두 대립유전자 모두에서 이형접합성 엑손 7 결실이 없거나 결실된 샘플)에 대해 특정 신호가 얻어집니다. SMN1 유전자에서 동형접합성 엑손 7 결실이 검출되면 SMA 선별검사는 양성으로 간주됩니다. PCR 증폭이 없다는 것은 기능적인 SMN1 복사본이 없다는 것을 의미합니다. 즉, 영향을 받은 신생아입니다. 이형접합성 개체는 이 방법으로 검출할 수 없습니다. 검출률, 위양성 및 위음성 결과 두 질병에 대해 전체 검출률은 95% 이상으로 가정됩니다. 위음성 심사 결과가 나올 가능성은 거의 없습니다. 시스틴증에서는 이전에 알려지지 않은 희귀한 돌연변이나 가장 흔한 세 가지 돌연변이 중 어느 하나도 보유하지 않은 환자로 인해 위음성 결과가 발생할 수 있습니다. SMA에서는 이형접합성 결실과 점 돌연변이가 결합된 환자는 고려되지 않습니다. 시스틴증이나 SMA 증상이 있는 환자의 경우 선별검사와 독립적으로 추가 진단 테스트가 수행됩니다.

위양성 검사 결과도 거의 발생하지 않습니다. 시스틴증에서 이형접합성 샘플은 "대립유전자 탈락"(프라이머 결합 영역의 돌연변이로 인한 대립유전자의 PCR 실패)으로 인해 동형접합성으로 잘못 나타날 수 있습니다.

진단의 확인 시스틴증: CTNS 유전자에 동형접합 또는 복합 이형접합 돌연변이가 있는 것으로 밝혀진 환자의 경우, EDTA 혈액에서 백혈구 내 시스틴 수치를 측정하여 진단을 확정합니다. 이 샘플은 생후 14일 이내에 뮌스터에 있는 대사 실험실로 보내집니다.

SMA: SMN1 유전자의 엑손 7이 동형접합성인 경우 SMA를 가정해야 합니다(가장 심각한 과정에서 I형이 > 50%). SMA의 심각도를 분류하려면 SMN-2 복사본 수를 기록하여 추가 진단이 필요합니다. 또 다른 혈액 샘플은 담당 진료 센터에서 울름에 있는 참고 실험실로 보내질 것입니다. 검증시험 결과는 품질관리를 위해 선별검사실로 전달됩니다.

영향을 받은 아동 시스틴증 관리: 시스틴증 검사 결과 양성인 아동은 가장 가까운 대사 질환 센터로 의뢰됩니다. 시스테아민 치료는 진단이 확정된 후 즉시 시작됩니다.

SMA: SMA 검사 결과가 긍정적인 어린이는 Dr. von Hauner 아동 병원(바바리아)의 사회 소아과 센터 내 신경근 질환 센터 또는 에센 및 뮌스터 대학 병원으로 의뢰됩니다.

프로젝트 범위 이 프로젝트는 처음에는 샘플 200,000개로 제한되었으며 확장 가능성이 있었습니다.