Vastasyntyneen geneettinen seulonta kystinoosin ja spinaalisen lihasatrofian varalta (GENESIS1)

Väestöpohjainen vastasyntyneiden seulonta (NBS) on tärkeä kansanterveysohjelma, joka on parantanut huomattavasti useiden sairauksien etenemistä varhaisen havaitsemisen ansiosta. Seulottujen häiriöiden valinta noudattaa yleensä Wilsonin ja Jungnerin hahmottelemia 10 periaatetta. Saksassa NBS on ollut vapaaehtoinen National Health Service -ohjelma vuodesta 1969, joka kattaa tällä hetkellä 17 sairautta. Nykyiset NBS-menetelmät, joissa käytetään vastasyntyneiden kuivuneiden veripisteiden tandemmassaspektrometristä analyysiä, eivät pysty havaitsemaan monia mahdollisesti hoidettavissa olevia geneettisiä tiloja. Samaan aikaan molekyylipohjainen NBS on yhä käyttökelpoisempi, koska DNA:ta voidaan erottaa kuivatusta veripisteestä, seuraavan sukupolven sekvensointi on tullut taloudellisemmaksi ja molekyylidiagnostiikan luotettavuus ja validiteetti lisääntyvät geneettisten tietokantojen tarkentuessa ja kattavammin. Nefropaattinen kystinoosi ja spinaalinen lihasatrofia (SMA) ovat kelvollisia molekyylipohjaiseen NBS:ään, koska tehokkaita hoitoja on saatavilla.

Tämä tutkimus tarjoaa tieteellisen perustan vastasyntyneiden kystinoosin ja SMA:n seulonnalle ja tutkii, pitäisikö näiden sairauksien sisällyttämistä yleiseen vastasyntyneiden seulomiseen suositella. Tarkkailemalla tunnistettuja imeväisiä verrattuna oireellisesti diagnosoituihin potilaisiin pilottihankkeen ulkopuolella selvitämme, johtaako varhainen diagnoosi ja hoidon aloittaminen suotuisampaan ennusteeseen ja missä määrin.

Kystinoosi: Kystinoosi on harvinainen autosomaalinen resessiivinen systeeminen sairaus, jolla on korkea sairastuvuus ja kuolleisuus, jotka johtuvat lysosomaalista kystiininkuljettajakystinosiinia koodaavan CTNS-geenin patogeenisistä varianteista, mikä johtaa kystiinin kertymiseen lysosomiin. Elinikäinen kystiiniä heikentävä hoito suun kautta otettavalla kysteamiinilla, joka on ainoa spesifinen kystinoosin hoito, sekä munuaiskorvaushoidon saatavuus lapsuudessa on parantanut dramaattisesti potilaiden tuloksia. On olemassa vankkaa näyttöä siitä, että kysteamiinihoidon varhainen aloittaminen ja jatkuva hoito ovat molemmat välttämättömiä kroonisen munuaissairauden (CKD) etenemisen ja pääte-elinvaurion hidastamiseksi.

Tällä hetkellä kystinoosin diagnoosi perustuu kohonneisiin kystiinipitoisuuksiin valkosoluissa. Tämä menetelmä ei sovellu NBS:lle.

Spinaalinen lihasatrofia (SMA): Spinaalilihasten atrofiaa esiintyy noin 1:10 000 elävänä syntynyttä lasta Saksassa. Se periytyy autosomaalisesti resessiivisesti. Vastasyntyneet, joilla on spinaalinen lihasatrofia, ovat ilman kliinisiä oireita syntymän jälkeen.

Selkärangan lihasatrofian syy on eksonin 7 deleetio SMN1-geenissä, joka koodaa "selviytymismoottorin neuroniproteiinia". Homotsygoottisesta deleetiosta puuttuu toiminnallinen SMN-proteiini, josta selkäytimen etusarvisolut ovat riippuvaisia. Heterotsygoottiset kantajat ovat oireettomia. Toimivan SMN-proteiinin puute johtaa selkäytimen motoristen neuronien vaurioitumiseen, mikä johtaa vakavaan neurogeeniseen uudelleenmuodostukseen ja luurankolihasten surkastumiseen.

SMN1-geenin lisäksi ihmisillä on lähes identtinen, vierekkäin sijaitseva "pseudogeeni", SMN2-geeni. Se eroaa SMN1-geenistä vain 5 yksittäisellä emäsparilla. SMN2-proteiinilla ei ole merkitystä terveillä ihmisillä, koska läsnä on riittävästi toiminnallista SMN1-proteiinia. SMN2-geeni sisältää molekyylikytkimen, joka voi sulkea kokonaan geenin ilmentymisen. Selkärangan lihasatrofian kliininen vaihtelevuus selittyy SMN2-proteiinin erilaisella ilmentymisellä. Siten SMN2-geenin, mukaan lukien sen eksoni 7, lukeminen sammutuskytkimen estämisellä edustaa terapeuttista kohdetta SMA-potilaiden hoidossa. Hoidon mahdollisuus vaikuttaa positiivisesti taudin kulkuun osoitettiin lumekontrolloidussa monikeskustutkimuksessa Ionis/Biogenin antisense-oligonukleotidilla nusinersen (Spinraza®) vuosina 2015/2016.

Sairauden diagnoosi kliinisissä epäilyissä on tehty EDTA-verestä ja siitä eristetystä DNA:sta kohdistetulla SMN1- ja SMN2-geenien testauksella. Testi suoritetaan yleensä geneettisissä laboratorioissa käyttäen MLPA:ta (multiplex ligaation-dependent probe ampliification). Koska jokaista näytettä varten tarvitaan kaupallinen pakkaus, testi on liian kallis seulomiseen osana vastasyntyneen seulontaa.

Toimenpide:

Tutkimusväestö Saksan sairaalat voivat vapaasti valita, mihin 11 sertifioidusta laboratoriosta ne lähettävät kuivaveren pistekortit vastasyntyneiden seulontaa varten ja haluavatko ne osallistua pilottiprojekteihin.

Tässä hankkeessa Becker & Kollegen -laboratorio Münchenissä ja Hannoverin seulontalaboratorio tiedottavat lähettäjilleen mahdollisuudesta lisätä geneettinen kystinoosin (Hannover) tai kystinoosin ja SMA:n (München) seulonta rutiininomaisesti perustettuun vastasyntyneiden seulontaan.

Tutkimuspopulaatioon kuuluvat vastasyntyneet, joiden vanhemmat haluavat osallistua pilottihankkeeseen ja ovat antaneet kirjallisen tietoisen suostumuksen. Mukana on lisätieto- ja suostumuslomake kystinoosin ja SMA-seulontaan, joka sisältää selvityksen seulontaprosessista ja tavoitteista, odotetuista hyödyistä, osallistumatta jättämisen mahdollisista haitallisista seurauksista sekä testitulosten merkityksestä. Vanhemmille kerrotaan, että heille ilmoitetaan normaaleista, ei-merkittävistä tuloksista vain pyynnöstä. Suostumus tulee dokumentoida vähintään yhden vanhemman allekirjoituksella ja suostumuslomakkeella ilmoittavan lääkärin allekirjoituksella. Pilottiprojektin suostumuslomake sisältää myös suostumuksen yhteystietojen ja havaintojen jakamiseen erikoiskeskuksen kanssa, jos seulontatulos on poikkeava.

Jos tulos on positiivinen, laboratorion on ensin ilmoitettava asiasta lähettäjälle ja selvitettävä, onko lapsi edelleen sairaalassa vai ei. Jos lapsi on edelleen laitoshoidossa, lähettäjä saa lähtötiedot vanhemmilta ja ilmoittaa asiantuntijalle vastaavan diagnoosin tekemiseksi. Jos lapsi on jo kotiutettu sairaalasta, laboratorio ottaa suoraan yhteyttä asianmukaiseen asiantuntijaan (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, München).

Näytteenotto Molekyyligeneettinen seulonta suoritetaan käyttämällä samaa kuivaverikorttia (veripisaroita suodatinpaperikortille) kuin rutiini-NBS. Ylimääräistä verenottoa ei tarvita. Jos materiaalia on vähän saatavilla, suoritetaan ensin tavallinen NBS, jonka jälkeen seulonta kystinoosin ja SMA:n varalta. Lastenlääkettä koskevan ohjeen mukaan verinäyte NBS:ää varten tulee kerätä 36–72 elintunnin välillä.

Yleensä kaikkien virheellisten tulosten (eli jos kontrollireaktio epäonnistuu) ja kaikkien epänormaalien tulosten osalta testi toistetaan sisäisesti varmistua varten käytettävissä olevalla verinäytteellä. Jos verinäytteen laatu on huono (esim. liian vähän verta), laboratorio pyytää uuden verinäytteen. Jos materiaalia on liian vähän tarvittavan seuraavan sukupolven sekvensoinnin suorittamiseen, laboratorio pyytää myös toisen kuivatun verinäytteen.

Mittaukset ja menetelmät Kystinoosi: Kystinoosiseulontaa varten tehtiin ensimmäisessä vaiheessa multipleksinen PCR kolme yleisintä CTNS-mutaatiota Saksassa, eli 57 kb:n deleetio (vastuussa noin puolesta kystinoosista Euroopassa ja Pohjois-Amerikassa) c.18_21delGACT, p. .T7Ffs*7 ja c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Heterotsygoottisille näytteille suoritetaan amplikonipohjainen seuraavan sukupolven sekvensointi 101 patogeenisen mutaation varalta. Tämä lähestymistapa ennustaa havaitsemisasteen 96,5 %.

SMA Edellä kuvattujen CTNS-mutaatioiden tripleksi-PCR on täydennetty toisella PCR:llä, joka havaitsee eksonin 7 SMN1-geenissä. Tällä kvadrupleksi-PCR:llä saadaan spesifinen signaali normaaleille näytteille (niille, joissa ei ole heterotsygoottista eksonin 7 deleetiota tai joissa on heterotsygoottinen eksonin 7 deleetio molemmissa SMN1-geenin alleeleissa). SMA-seulonta katsotaan positiiviseksi, jos SMN1-geenissä havaitaan homotsygoottinen eksonin 7 deleetio. PCR-monistuksen puuttuminen osoittaa toiminnallisen SMN1-kopion, eli sairaan vastasyntyneen, puuttumisen. Heterotsygoottisia yksilöitä ei voida havaita tällä menetelmällä Havaitsemisprosentti, väärät positiiviset ja väärät negatiiviset tulokset Kummankin taudin kokonaishavaitsemisasteen oletetaan olevan yli 95 %. Väärät negatiiviset seulontatulokset ovat epätodennäköisiä. Kystinoosissa väärät negatiiviset tulokset ovat mahdollisia johtuen aiemmin tuntemattomista harvinaisista mutaatioista tai potilaista, joilla ei ole mitään kolmesta yleisimmästä mutaatiosta. SMA:ssa ei oteta huomioon potilaita, joilla heterotsygoottinen deleetio on yhdistetty pistemutaatioon. Potilaille, joilla on kystinoosin tai SMA:n oireita, tehdään lisätestejä seulonnasta riippumatta.

Väärät positiiviset seulontatulokset ovat myös erittäin epätodennäköisiä. Kystinoosissa heterotsygoottinen näyte voi virheellisesti näyttää homotsygoottiselta "alleelisen poistumisen" vuoksi (alleelin PCR-epäonnistuminen alukkeen sitoutumisalueen mutaatioiden vuoksi).

Diagnoosin vahvistus Kystinoosi: Potilailla, joilla on joko homotsygoottinen tai heterotsygoottinen yhdistemutaatio CTNS-geenissä, diagnoosi vahvistetaan määrittämällä intraleukosyyttinen kystiinitaso EDTA-verestä. Tämä näyte lähetetään Münsterin aineenvaihduntalaboratorioon 14 ensimmäisen elinpäivän aikana.

SMA: Jos SMN1-geenin eksoni 7 on homotsygoottinen, SMA on oletettava (> 50 % tyypin I vaikeimmalla taudilla). SMA:n vakavuuden luokittelu edellyttää lisädiagnostiikkaa tallentamalla SMN-2-kopioiden lukumäärä. Vastaava hoitokeskus lähettää toisen verinäytteen Ulmin vertailulaboratorioon. Varmennustestien tulokset toimitetaan seulontalaboratorioon laadunvalvontaa varten.

Sairastuneen lapsen hoito Kystinoosi: Lapset, joiden kystinoosiseulontatulos on positiivinen, ohjataan lähimpään aineenvaihduntakeskukseen. Kysteamiinihoito aloitetaan heti diagnoosin vahvistamisen jälkeen.

SMA: Lapset, joilla on positiiviset SMA-seulontatulokset, ohjataan joko Dr. von Haunerin lastensairaalan (Baijeri) sosiaalipediatrian keskukseen tai Essenin ja Münsterin yliopistollisiin sairaaloihin.

Hankkeen laajuus Projekti rajattiin alun perin 200 000 näytteeseen, ja sitä oli mahdollista laajentaa.