Genetický novorozenecký screening na cystinózu a spinální svalovou atrofii (GENESIS1)

Populační screening novorozenců (NBS) je důležitým programem veřejného zdraví, který díky včasnému odhalení výrazně zlepšil průběh několika onemocnění. Výběr vyšetřovaných poruch se obecně řídí 10 principy nastíněnými Wilsonem a Jungnerem. V Německu je NBS od roku 1969 dobrovolným programem Národní zdravotní služby, který v současnosti pokrývá 17 poruch. Současné metody NBS, které využívají tandemovou hmotnostně spektrometrickou analýzu zaschlých krevních skvrn novorozenců, nemohou detekovat mnoho potenciálně léčitelných genetických stavů. Současně je NBS na molekulární bázi stále proveditelnější, protože DNA lze extrahovat ze zaschlé krevní skvrny, sekvenování nové generace se stalo ekonomickým a molekulární diagnostika má větší spolehlivost a větší validitu, protože genetické databáze jsou stále rafinovanější a komplexnější. Nefropatická cystinóza a spinální muskulární atrofie (SMA) jsou vhodné pro molekulární NBS, protože jsou k dispozici účinné terapie.

Tato studie poskytne vědecký základ pro novorozenecký screening cystinózy a SMA a prozkoumá, zda by mělo být doporučeno zařazení těchto onemocnění do obecného novorozeneckého screeningu. Pozorováním identifikovaných kojenců ve srovnání se symptomaticky diagnostikovanými pacienty mimo pilotní projekt určíme, zda a do jaké míry vede včasná diagnostika a zahájení terapie k příznivější prognóze.

Cystinóza: Cystinóza je vzácné autozomálně recesivní systémové onemocnění s vysokou morbiditou a mortalitou způsobené patogenními variantami v genu CTNS, který kóduje lysozomální cystinový transportér cystinosin, což vede k akumulaci cystinu v lysozomu. Celoživotní cystin-depleční terapie perorálním cysteaminem, jedinou specifickou terapií cystinózy, spolu s dostupností renální substituční terapie v dětství, dramaticky zlepšila výsledky pacientů. Existují pádné důkazy, že časné zahájení a trvalá léčba cysteaminem jsou zásadní pro oddálení progrese chronického onemocnění ledvin (CKD) a poškození koncových orgánů.

V současné době je diagnóza cystinózy založena na přítomnosti zvýšené hladiny cystinu v bílých krvinkách. Tato metoda je pro NBS nevhodná.

Spinální svalová atrofie (SMA): Spinální svalová atrofie má v Německu prevalenci přibližně 1:10 000 živě narozených dětí. Dědí se autozomálně recesivním způsobem. Novorozenci se spinální svalovou atrofií jsou po narození bez klinických příznaků.

Příčinou spinální svalové atrofie je delece exonu 7 v genu SMN1, kódujícím genu pro „protein motorického neuronu přežití“. Homozygotní delece postrádá funkční protein SMN, na kterém závisí buňky předního rohu v míše. Heterozygotní nosiči jsou asymptomatičtí. Nedostatek funkčního proteinu SMN má za následek poškození motorických neuronů na úrovni míchy, což vede k těžké neurogenní remodelaci a atrofii kosterních svalů.

Kromě genu SMN1 mají lidé téměř identický, vedle sebe umístěný „pseudogen“, gen SMN2. Od genu SMN1 se liší pouze 5 jednotlivými páry bází. Protein SMN2 nehraje u zdravých lidí žádnou roli, protože je přítomen dostatek funkčního proteinu SMN1. Gen SMN2 obsahuje molekulární spínač, který může zcela zastavit expresi genu. Klinická variabilita spinální svalové atrofie se vysvětluje rozdílnou expresí proteinu SMN2. Načtení genu SMN2 včetně jeho exonu 7 inhibicí vypínání tedy představuje terapeutický cíl pro léčbu pacientů se SMA. Možnost terapie pozitivně ovlivnit průběh onemocnění byla prokázána v placebem kontrolované multicentrické studii s antisense oligonukleotidem nusinersen (Spinraza®) od Ionis/Biogen v roce 2015/2016.

Diagnostika onemocnění v případech klinického podezření byla stanovena cíleným testováním genů SMN1 a SMN2 z krve EDTA az ní izolované DNA. Test se obvykle provádí v genetických laboratořích pomocí MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Vzhledem k tomu, že pro každý vzorek je vyžadována komerční sada, je test pro screening v rámci novorozeneckého screeningu příliš nákladný.

Postup:

Studijní populace Nemocnice v Německu si mohou svobodně vybrat, do které z 11 certifikovaných laboratoří zašlou karty suchých krevních skvrn na novorozenecký screening a zda se chtějí zúčastnit pilotních projektů.

Laboratoř Becker & Kollegen v Mnichově a screeningová laboratoř Hannover v tomto projektu informují své odesílatele o možnosti přidat k rutinně zavedenému novorozeneckému screeningu genetický screening cystinózy (Hannover) nebo cystinózy a SMA (Mnichov).

Studovaná populace zahrnuje novorozence, jejichž rodiče si přejí účastnit se pilotního projektu a poskytli písemný informovaný souhlas. Je poskytnut další informační a souhlasný list pro cystinózu a screening SMA, který obsahuje vysvětlení procesu a cílů screeningu, očekávané přínosy, možné nepříznivé důsledky neúčasti a význam výsledků testu. Rodiče jsou informováni, že o normálních, nevýrazných výsledcích budou informováni pouze na vyžádání. Souhlas musí být doložen podpisem alespoň jednoho rodiče a podpisem informujícího lékaře na formuláři souhlasu. Formulář souhlasu s pilotním projektem obsahuje také souhlas se sdílením kontaktních informací a nálezů se specializovaným centrem v případě abnormálního výsledku screeningu.

V případě pozitivního výsledku musí laboratoř nejprve informovat odesílatele a objasnit, zda je či není dítě stále v nemocnici. Pokud je dítě stále v ústavní léčbě, získá odesílatel prvotní informace od rodičů a upozorní odborníka na příslušnou diagnózu. Pokud již bylo dítě propuštěno z nemocnice, laboratoř kontaktuje přímo příslušného odborníka (Cystinóza: Priv.-Doz. Dr. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, Mnichov).

Odběr vzorků Molekulárně genetický screening se provádí pomocí stejné karty suché krve (kapky krve na kartě filtračního papíru) jako rutinní NBS. Není potřeba žádný další odběr krve. Pokud je k dispozici málo materiálu, provede se nejprve běžná NBS a poté screening na cystinózu a SMA. Podle pediatrické směrnice by měl být vzorek krve pro NBS odebrán mezi 36. a 72. hodinou života.

Obecně platí, že pro všechny neplatné výsledky (tj. pokud kontrolní reakce selže) a pro všechny abnormální výsledky se test interně opakuje pro potvrzení pomocí dostupného vzorku krve. Pokud je kvalita vzorku krve špatná (např. příliš málo krve), laboratoř si vyžádá nový vzorek krve. Pokud je k provedení požadovaného sekvenování nové generace příliš málo materiálu, laboratoř si také vyžádá další vysušený vzorek krve.

Měření a metody Cystinóza: Pro screening cystinózy byla v první fázi provedena multiplexní PCR k detekci tří nejčastějších mutací CTNS v Německu, tj. delece 57 kb (zodpovědná za asi polovinu cystinózy v Evropě a Severní Americe) c.18_21delGACT, p. .T7Ffs*7 a c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Heterozygotní vzorky budou podrobeny sekvenování nové generace na bázi amplikonu pro 101 patogenních mutací. Tento přístup předpovídá míru detekce 96,5 %.

SMA Triplexová PCR pro CTNS mutace popsané výše je doplněna další PCR, která detekuje exon 7 v genu SMN1. Touto kvadruplexní PCR se získá specifický signál pro normální vzorky (ty bez nebo s heterozygotní delecí exonu 7 v obou alelách genu SMN1). Screening SMA je považován za pozitivní, pokud je v genu SMN1 detekována homozygotní delece exonu 7. Absence PCR amplifikace indikuje nepřítomnost funkční kopie SMN1, tj. postiženého novorozence. Heterozygotní jedinci nelze touto metodou detekovat Míra záchytu, falešně pozitivní a falešně negativní výsledky U obou onemocnění se předpokládá celková záchytnost více než 95 %. Falešně negativní výsledky screeningu jsou nepravděpodobné. U cystinózy jsou možné falešně negativní výsledky v důsledku dříve neznámých vzácných mutací nebo pacientů, kteří nenesou žádnou ze tří nejčastějších mutací. U SMA nejsou uvažováni pacienti, u kterých je heterozygotní delece kombinována s bodovou mutací. U pacientů s příznaky cystinózy nebo SMA se další diagnostické testy provádějí nezávisle na screeningu.

Falešně pozitivní výsledky screeningu jsou také velmi nepravděpodobné. Při cystinóze se heterozygotní vzorek může falešně jevit jako homozygotní v důsledku „alelického výpadku“ (selhání PCR alely v důsledku mutací v oblasti vazby primeru).

Potvrzení diagnózy Cystinóza: U pacientů, u kterých byla zjištěna buď homozygotní nebo složená heterozygotní mutace v genu CTNS, je diagnóza potvrzena stanovením hladiny intraleukocytárního cystinu z krve EDTA. Tento vzorek je odeslán do metabolické laboratoře v Münsteru během prvních 14 dnů života.

SMA: Pokud je exon 7 v genu SMN1 homozygotní, je třeba předpokládat SMA (> 50 % typu I s nejzávažnějším průběhem). Aby bylo možné klasifikovat závažnost SMA, je nutná další diagnostika zaznamenáním počtu kopií SMN-2. Další vzorek krve zašle centrum odpovědné péče do referenční laboratoře v Ulmu. Výsledky ověřovacích testů jsou předány screeningové laboratoři ke kontrole kvality.

Péče o postižené dítě Cystinóza: Děti s pozitivními výsledky screeningu cystinózy jsou odesílány do nejbližšího centra metabolických chorob. Léčba cysteaminem bude zahájena ihned po potvrzení diagnózy.

SMA: Děti s pozitivními výsledky screeningu SMA jsou odesílány buď do Centra pro neuromuskulární onemocnění v Sociálně-pediatrickém centru Dětské nemocnice Dr. von Haunera (Bavorsko) nebo do fakultních nemocnic v Essenu a Münsteru.

Rozsah projektu Projekt byl zpočátku omezen na 200 000 vzorků s možností rozšíření.