Screening genetico neonatale per cistinosi e atrofia muscolare spinale (GENESIS1)

Lo screening neonatale su base di popolazione (NBS) è un importante programma di sanità pubblica che ha notevolmente migliorato il decorso di diverse malattie attraverso la diagnosi precoce. La selezione dei disturbi esaminati segue generalmente i 10 principi delineati da Wilson e Jungner. In Germania, l’NBS è un programma volontario del Servizio Sanitario Nazionale dal 1969 che attualmente copre 17 disturbi. Gli attuali metodi NBS, che impiegano l’analisi spettrometrica di massa tandem di macchie di sangue essiccato dei neonati, non sono in grado di rilevare molte condizioni genetiche potenzialmente curabili. Allo stesso tempo, la NBS su base molecolare è sempre più fattibile perché il DNA può essere estratto da una macchia di sangue essiccato, il sequenziamento di prossima generazione è diventato economico e la diagnostica molecolare ha una maggiore affidabilità e una maggiore validità man mano che i database genetici diventano più raffinati e completi. La cistinosi nefropatica e l'atrofia muscolare spinale (SMA) sono idonee alla NBS su base molecolare perché sono disponibili terapie efficaci.

Questo studio fornirà una base scientifica per lo screening neonatale della cistinosi e della SMA e valuterà se sia opportuno raccomandare l'inclusione di queste malattie nello screening neonatale generale. Osservando i neonati identificati rispetto ai pazienti con diagnosi sintomatica al di fuori del progetto pilota, determineremo se e in che misura la diagnosi precoce e l'inizio della terapia portano a una prognosi più favorevole.

Cistinosi: la cistinosi è una rara malattia sistemica autosomica recessiva con elevata morbilità e mortalità causata da varianti patogene nel gene CTNS che codifica per la cistinosina, trasportatore lisosomiale della cistina, che porta all'accumulo di cistina all'interno del lisosoma. La terapia per la deplezione della cistina per tutta la vita con cisteamina orale, l’unica terapia specifica per la cistinosi, insieme alla disponibilità della terapia sostitutiva renale durante l’infanzia, ha migliorato notevolmente gli esiti dei pazienti. Esistono prove robuste che l’inizio precoce e la terapia prolungata con cisteamina sono entrambi essenziali per ritardare la progressione verso la malattia renale cronica (CKD) e il danno d’organo.

Attualmente, la diagnosi di cistinosi si basa sulla presenza di elevati livelli di cistina nei globuli bianchi. Questo metodo non è adatto per NBS.

Atrofia muscolare spinale (SMA): l'atrofia muscolare spinale ha una prevalenza di circa 1:10.000 nati vivi in ​​Germania. Si trasmette con modalità autosomica recessiva. I neonati affetti da atrofia muscolare spinale non presentano sintomi clinici dopo la nascita.

La causa dell'atrofia muscolare spinale è la delezione dell'esone 7 del gene SMN1, il gene che codifica per la "proteina del motoneurone di sopravvivenza". La delezione omozigote manca della proteina funzionale SMN da cui dipendono le cellule del corno anteriore nel midollo spinale. I portatori eterozigoti sono asintomatici. La mancanza della proteina SMN funzionale provoca danni ai motoneuroni a livello del midollo spinale, portando a un grave rimodellamento neurogenico e all’atrofia dei muscoli scheletrici.

Oltre al gene SMN1, gli esseri umani hanno uno "pseudogene" quasi identico, situato in posizione adiacente, il gene SMN2. Differisce dal gene SMN1 solo per 5 singole paia di basi. La proteina SMN2 non svolge alcun ruolo negli esseri umani sani, poiché è presente una quantità sufficiente di proteina SMN1 funzionale. Il gene SMN2 contiene un interruttore molecolare che può interrompere completamente l'espressione del gene. La variabilità clinica dell'atrofia muscolare spinale è spiegata dall'espressione differenziale della proteina SMN2. Pertanto, la lettura del gene SMN2 compreso il suo esone 7 mediante l'inibizione dell'interruttore di spegnimento rappresenta un bersaglio terapeutico per il trattamento dei pazienti SMA. La possibilità di una terapia di influenzare positivamente il decorso della malattia è stata dimostrata nello studio multicentrico controllato con placebo con un oligonucleotide antisenso nusinersen (Spinraza®) di Ionis/Biogen nel 2015/2016.

La diagnosi della malattia in caso di sospetto clinico è stata effettuata mediante test mirati dei geni SMN1 e SMN2 dal sangue EDTA e dal DNA isolato da essi. Il test viene solitamente eseguito nei laboratori di genetica utilizzando MLPA (amplificazione della sonda dipendente dalla legatura multipla). Poiché per ciascun campione è necessario un kit commerciale, il test è troppo costoso per essere inserito nello screening neonatale.

Procedura:

Popolazione oggetto dello studio Gli ospedali in Germania sono liberi di scegliere a quale degli 11 laboratori certificati inviare le schede di sangue secco per lo screening neonatale e se desiderano partecipare a progetti pilota.

Nell'ambito di questo progetto, il laboratorio Becker & Kollegen di Monaco e il laboratorio di screening di Hannover informano i loro mittenti sulla possibilità di aggiungere allo screening neonatale di routine lo screening genetico per la cistinosi (Hannover) o la cistinosi e SMA (Monaco).

La popolazione in studio comprende neonati i cui genitori desiderano partecipare al progetto pilota e hanno fornito il consenso informato scritto. Viene fornito un foglio informativo e di consenso aggiuntivo per lo screening della cistinosi e della SMA, che include una spiegazione del processo e degli obiettivi dello screening, dei benefici attesi, delle possibili conseguenze avverse della mancata partecipazione e del significato dei risultati del test. Si informano i genitori che verranno informati dei risultati normali e insignificanti solo su richiesta. Il consenso deve essere documentato con la firma di almeno un genitore e la firma del medico informante sul modulo di consenso. Il modulo di consenso per il progetto pilota include anche il consenso a condividere le informazioni di contatto e i risultati con un centro specializzato in caso di risultato anomalo dello screening.

In caso di risultato positivo, il laboratorio dovrà prima informare il mittente e chiarire se il bambino è ancora ricoverato o meno. Se il bambino è ancora in cura stazionaria, il mittente riceve le prime informazioni dai genitori e informa un esperto per la relativa diagnosi. Se il bambino è già stato dimesso dall'ospedale, il laboratorio contatta direttamente l'esperto competente (Cistinosi: Priv.-Doz. Dott. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, Monaco).

Campionamento Lo screening genetico molecolare viene eseguito utilizzando la stessa scheda di sangue secco (gocce di sangue su una scheda di carta da filtro) dell'NBS di routine. Non è necessaria alcuna raccolta di sangue aggiuntiva. Se è disponibile poco materiale, viene eseguita prima la NBS regolare, seguita dallo screening per cistinosi e SMA. Secondo le linee guida pediatriche, il campione di sangue per la NBS dovrebbe essere raccolto tra le 36 e le 72 ore di vita.

In generale, per tutti i risultati non validi (ovvero se la reazione di controllo fallisce) e per tutti i risultati anomali il test viene ripetuto internamente per conferma utilizzando il campione di sangue disponibile. Se la qualità del campione di sangue è scarsa (ad esempio, troppo poco sangue), il laboratorio richiederà un nuovo campione di sangue. Se il materiale è insufficiente per eseguire il sequenziamento di prossima generazione richiesto, il laboratorio richiederà anche un altro campione di sangue essiccato.

Misurazioni e metodi Cistinosi: per lo screening della cistinosi, nella prima fase è stata eseguita la PCR multiplex per rilevare le tre mutazioni CTNS più comuni in Germania, ovvero una delezione di 57 kb (responsabile di circa la metà delle cistinosi in Europa e Nord America) c.18_21delGACT, p .T7Ffs*7 e c.926dupG, p.S310Qfs*55 . I campioni eterozigoti saranno sottoposti a sequenziamento di nuova generazione basato su ampliconi per 101 mutazioni patogene. Questo approccio prevede un tasso di rilevamento del 96,5%.

SMA La triplex PCR per le mutazioni CTNS sopra descritte è completata da un'altra PCR che rileva l'esone 7 nel gene SMN1. Con questa PCR quadruplex si ottiene un segnale specifico per i campioni normali (quelli senza o con delezione eterozigote dell'esone 7 in entrambi gli alleli del gene SMN1). Lo screening della SMA è considerato positivo se viene rilevata una delezione omozigote dell'esone 7 nel gene SMN1. L'assenza di amplificazione della PCR indica l'assenza di una copia SMN1 funzionale, cioè un neonato affetto. Gli individui eterozigoti non possono essere rilevati con questo metodo Tasso di rilevamento, risultati falsi positivi e falsi negativi Per entrambe le malattie si presuppone un tasso di rilevamento complessivo superiore al 95%. Sono improbabili risultati falsi negativi dello screening. Nella cistinosi, sono possibili risultati falsi negativi dovuti a mutazioni rare precedentemente sconosciute o a pazienti che non sono portatori di nessuna delle tre mutazioni più comuni. Nella SMA non vengono considerati i pazienti nei quali una delezione eterozigote è associata ad una mutazione puntiforme. Nei pazienti con sintomi di cistinosi o SMA, vengono eseguiti ulteriori test diagnostici indipendentemente dallo screening.

Anche i risultati dello screening falsi positivi sono molto improbabili. Nella cistinosi, un campione eterozigote può apparire erroneamente come omozigote a causa del "dropout allelico" (fallimento della PCR di un allele dovuto a mutazioni nella regione di legame del primer).

Conferma della diagnosi Cistinosi: nei pazienti con mutazione omozigote o eterozigote composta in un gene CTNS, la diagnosi viene confermata determinando il livello di cistina intraleucocitaria nel sangue EDTA. Questo campione viene inviato al laboratorio metabolico di Münster entro i primi 14 giorni di vita.

SMA: se l'esone 7 del gene SMN1 è omozigote, si deve presupporre la SMA (> 50% tipo I con decorso più grave). Per classificare la gravità della SMA, sono necessarie ulteriori diagnosi registrando il numero di copie SMN-2. Un altro campione di sangue verrà inviato dal centro di cura responsabile al laboratorio di riferimento di Ulm. I risultati dei test di verifica vengono inoltrati al laboratorio di screening per il controllo di qualità.

Cura del bambino affetto Cistinosi: i bambini con risultati positivi allo screening per la cistinosi vengono indirizzati al centro di malattie metaboliche più vicino. La terapia con cisteamina verrà iniziata immediatamente dopo la conferma della diagnosi.

SMA: i bambini con risultati positivi allo screening SMA vengono indirizzati al Centro per le malattie neuromuscolari del Centro sociale pediatrico dell'Ospedale pediatrico Dr. von Hauner (Baviera) o agli ospedali universitari di Essen e Münster.

Ambito del progetto Il progetto era inizialmente limitato a 200.000 campioni, con possibilità di espansione.