Genetisk nyfødtscreening for cystinose og spinal muskelatrofi (GENESIS1)

Populasjonsbasert nyfødtscreening (NBS) er et viktig folkehelseprogram som har forbedret forløpet av flere sykdommer betydelig gjennom tidlig oppdagelse. Utvalget av screenede lidelser følger generelt de 10 prinsippene som er skissert av Wilson og Jungner. I Tyskland har NBS vært et frivillig nasjonalt helsetjenesteprogram siden 1969 som for tiden dekker 17 lidelser. Nåværende NBS-metoder, som benytter tandem massespektrometrisk analyse av tørkede blodflekker på nyfødte, kan ikke oppdage mange potensielt behandlelige genetiske tilstander. Samtidig er molekylærbasert NBS i økende grad mulig fordi DNA kan ekstraheres fra en tørket blodflekk, neste generasjons sekvensering har blitt økonomisk, og molekylær diagnostikk har større pålitelighet og økt validitet ettersom genetiske databaser blir mer raffinerte og omfattende. Nefropatisk cystinose og spinal muskelatrofi (SMA) er kvalifisert for molekylærbasert NBS fordi effektive terapier er tilgjengelige.

Denne studien skal gi et vitenskapelig grunnlag for nyfødtscreening for cystinose og SMA og undersøke om inkludering av disse sykdommene i generell nyfødtscreening bør anbefales. Ved å observere identifiserte spedbarn sammenlignet med symptomatisk diagnostiserte pasienter utenfor pilotprosjektet, vil vi finne ut om og i hvilken grad tidlig diagnose og igangsetting av terapi fører til en gunstigere prognose.

Cystinose: Cystinose er en sjelden autosomal recessiv systemisk sykdom med høy morbiditet og dødelighet forårsaket av patogene varianter i CTNS-genet som koder for den lysosomale cystintransportøren cystinosin, noe som fører til akkumulering av cystin i lysosomet. Livslang cystindepleterende behandling med oral cysteamin, den eneste spesifikke behandlingen for cystinose, sammen med tilgjengeligheten av nyreerstatningsterapi i barndommen, har dramatisk forbedret pasientresultatene. Det er solid bevis for at tidlig oppstart og vedvarende behandling med cysteamin begge er avgjørende for å forsinke progresjon til kronisk nyresykdom (CKD) og endeorganskade.

Foreløpig er diagnosen cystinose basert på tilstedeværelsen av forhøyede cystinnivåer i hvite blodlegemer. Denne metoden er uegnet for NBS.

Spinal muskelatrofi (SMA): Spinal muskelatrofi har en prevalens på omtrent 1:10 000 levendefødte i Tyskland. Det arves på en autosomal recessiv måte. Nyfødte med spinal muskelatrofi er uten kliniske symptomer etter fødselen.

Årsaken til spinal muskelatrofi er en sletting av ekson 7 i SMN1-genet, det kodende genet for "overlevelsesmotorneuronproteinet". Homozygot delesjon mangler det funksjonelle SMN-proteinet som de fremre horncellene i ryggmargen er avhengig av. Heterozygote bærere er asymptomatiske. Mangel på det funksjonelle SMN-proteinet resulterer i skade på motoriske nevroner på ryggmargsnivå, noe som fører til alvorlig nevrogen ombygging og atrofi av skjelettmuskulatur.

I tillegg til SMN1-genet har mennesker et nesten identisk "pseudo-gen", SMN2-genet. Det skiller seg fra SMN1-genet bare med 5 enkle basepar. SMN2-proteinet spiller ingen rolle hos friske mennesker, siden tilstrekkelig funksjonelt SMN1-protein er tilstede. SMN2-genet inneholder en molekylær bryter som fullstendig kan stenge ekspresjonen av genet. Den kliniske variasjonen av spinal muskelatrofi forklares av differensiell ekspresjon av SMN2-proteinet. Dermed representerer avlesningen av SMN2-genet inkludert dets ekson 7 ved inhibering av av-bryteren et terapeutisk mål for behandling av SMA-pasienter. Muligheten for en terapi for å påvirke sykdomsforløpet positivt ble demonstrert i den placebokontrollerte multisenterstudien med et antisense oligonukleotid nusinersen (Spinraza®) fra Ionis/Biogen i 2015/2016.

Diagnostisering av sykdommen i tilfeller med klinisk mistanke er gjort ved målrettet testing av SMN1- og SMN2-genene fra EDTA-blod og DNA isolert derfra. Testen utføres vanligvis i genetikklaboratorier ved bruk av MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Fordi det kreves et kommersielt sett for hver prøve, er testen for kostbar for screening som en del av nyfødtscreening.

Fremgangsmåte:

Studiepopulasjon Sykehusene i Tyskland står fritt til å velge hvilke av de 11 sertifiserte laboratoriene de sender tørrblodflekkkortene til for nyfødtscreening og om de vil delta i pilotprosjekter.

I dette prosjektet informerer Becker & Kollegen-laboratoriet i München og Hannover-screeningslaboratoriet sine avsendere om muligheten for å legge til genetisk screening for cystinose (Hannover) eller cystinose og SMA (München) til den rutinemessig etablerte nyfødtscreeningen.

Studiepopulasjonen inkluderer nyfødte hvis foreldre ønsker å delta i pilotprosjektet og har gitt skriftlig informert samtykke. Det gis et tilleggsinformasjons- og samtykkeark for cystinose- og SMA-screening, som inkluderer en forklaring av screeningsprosessen og mål, forventede fordeler, mulige uheldige konsekvenser av manglende deltakelse og betydningen av testresultatene. Foreldre blir informert om at de vil bli informert om normale, umerkelige resultater kun på forespørsel. Samtykke skal dokumenteres med underskrift av minst én forelder og underskrift av informerende lege på samtykkeskjema. Samtykkeskjemaet for pilotprosjektet inneholder også samtykke til å dele kontaktinformasjon og funn med et spesialsenter ved unormalt screeningsresultat.

Ved positivt resultat skal laboratoriet først informere avsender og avklare om barnet fortsatt er på sykehus eller ikke. Dersom barnet fortsatt er under døgnbehandling, innhenter avsender den første informasjonen fra foreldrene og varsler en sakkyndig for tilsvarende diagnose. Hvis barnet allerede er utskrevet fra sykehuset, kontakter laboratoriet den aktuelle eksperten direkte (Cystinosis: Priv.-Doz. Dr. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, München).

Prøvetaking Molekylær genetisk screening utføres med det samme tørre blodkortet (bloddråper på et filterpapirkort) som rutinemessig NBS. Ingen ekstra blodprøvetaking er nødvendig. Hvis lite materiale er tilgjengelig, utføres den vanlige NBS først, etterfulgt av screening for cystinose og SMA. I henhold til den pediatriske retningslinjen skal blodprøven for NBS tas mellom 36 og 72 timer av livet.

Generelt, for alle ugyldige resultater (dvs. hvis kontrollreaksjonen mislykkes) og for alle unormale resultater, gjentas testen internt for bekreftelse med den tilgjengelige blodprøven. Hvis kvaliteten på blodprøven er dårlig (f.eks. for lite blod), vil laboratoriet be om en ny blodprøve. Hvis det er for lite materiale til å utføre nødvendig neste generasjons sekvensering, vil laboratoriet også be om en ny tørket blodprøve.

Målinger og metoder Cystinose: For cystinosescreening ble multipleks PCR utført i det første stadiet for å oppdage de tre vanligste CTNS-mutasjonene i Tyskland, dvs. en 57 kb-sletting (ansvarlig for omtrent halvparten av cystinose i Europa og Nord-Amerika) c.18_21delGACT, p. .T7Ffs*7 og c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Heterozygote prøver vil bli utsatt for amplikonbasert neste generasjons sekvensering for 101 patogene mutasjoner. Denne tilnærmingen forutsier en deteksjonsrate på 96,5 %.

SMA Tripleks-PCR for CTNS-mutasjonene beskrevet ovenfor er supplert med en annen PCR som detekterer ekson 7 i SMN1-genet. Med denne quadruplex PCR oppnås et spesifikt signal for normale prøver (de uten eller med heterozygot ekson 7-delesjon i begge alleler av SMN1-genet). SMA-screening anses som positiv hvis en homozygot ekson 7-sletting påvises i SMN1-genet. Fraværet av PCR-amplifikasjon indikerer fraværet av en funksjonell SMN1-kopi, dvs. en berørt nyfødt. Heterozygote individer kan ikke påvises med denne metoden Påvisningsrate, falske positive og falske negative resultater Det antas en samlet påvisningsrate på mer enn 95 % for begge sykdommene. Falske negative screeningsresultater er usannsynlige. Ved cystinose er falske negative resultater mulig på grunn av tidligere ukjente sjeldne mutasjoner eller pasienter som ikke bærer noen av de tre vanligste mutasjonene. Ved SMA vurderes ikke pasienter hvor en heterozygot delesjon er kombinert med en punktmutasjon. Hos pasienter med symptomer på cystinose eller SMA, utføres ytterligere diagnostiske tester uavhengig av screening.

Falske positive screeningsresultater er også svært usannsynlige. Ved cystinose kan en heterozygot prøve feilaktig fremstå som homozygot på grunn av "allelisk frafall" (PCR-svikt av en allel på grunn av mutasjoner i primerbindingsregionen).

Bekreftelse av diagnose Cystinose: Hos pasienter som har enten en homozygot eller sammensatt heterozygot mutasjon i et CTNS-gen, bekreftes diagnosen ved å bestemme det intraleukocytiske cystinnivået fra EDTA-blod. Denne prøven sendes til stoffskiftelaboratoriet i Münster i løpet av de første 14 dagene av livet.

SMA: Hvis ekson 7 i SMN1-genet er homozygot, må SMA antas (> 50 % type I med mest alvorlig forløp). For å klassifisere alvorlighetsgraden av SMA, kreves det ytterligere diagnostikk ved å registrere antall SMN-2 kopier. En annen blodprøve vil bli sendt av ansvarlig omsorgssenter til referanselaboratoriet i Ulm. Verifikasjonstestresultatene sendes til screeninglaboratoriet for kvalitetskontroll.

Pleie av det berørte barnet Cystinose: Barn med positive cystinosescreeningsresultater henvises til nærmeste stoffskiftesenter. Behandling med cysteamin vil starte umiddelbart etter at diagnosen er bekreftet.

SMA: Barn med positive SMA-screeningsresultater henvises enten til senteret for nevromuskulære sykdommer i det sosiale pediatriske senteret ved Dr. von Hauner barnesykehus (Bavaria) eller til universitetssykehusene i Essen og Münster.

Prosjektomfang Prosjektet var i utgangspunktet begrenset til 200 000 prøver, med mulighet for utvidelse.