Detección genética de cistinosis y atrofia muscular espinal en recién nacidos (GENESIS1)

El cribado neonatal (CNE) poblacional es un importante programa de salud pública que ha mejorado enormemente el curso de varias enfermedades mediante la detección temprana. La selección de los trastornos examinados generalmente sigue los diez principios descritos por Wilson y Jungner. En Alemania, el NBS es un programa voluntario del Servicio Nacional de Salud desde 1969 y actualmente cubre 17 enfermedades. Los métodos actuales de NBS, que emplean análisis espectrométricos de masas en tándem de manchas de sangre seca de recién nacidos, no pueden detectar muchas afecciones genéticas potencialmente tratables. Al mismo tiempo, la NBS de base molecular es cada vez más factible porque el ADN se puede extraer de una gota de sangre seca, la secuenciación de próxima generación se ha vuelto económica y los diagnósticos moleculares tienen mayor confiabilidad y mayor validez a medida que las bases de datos genéticas se vuelven más refinadas y completas. La cistinosis nefropática y la atrofia muscular espinal (AME) son elegibles para la NBS de base molecular porque hay terapias efectivas disponibles.

Este estudio proporcionará una base científica para el cribado neonatal de cistinosis y AME e investigará si se debe recomendar la inclusión de estas enfermedades en el cribado neonatal general. Al observar a los bebés identificados en comparación con los pacientes diagnosticados sintomáticamente fuera del proyecto piloto, determinaremos si y en qué medida el diagnóstico temprano y el inicio de la terapia conducen a un pronóstico más favorable.

Cistinosis: la cistinosis es una enfermedad sistémica autosómica recesiva poco común con alta morbilidad y mortalidad causada por variantes patogénicas en el gen CTNS que codifica el transportador lisosomal de cistina cistinosina, lo que lleva a la acumulación de cistina dentro del lisosoma. La terapia de por vida para reducir la cistina con cisteamina oral, la única terapia específica para la cistinosis, junto con la disponibilidad de terapia de reemplazo renal en la infancia, ha mejorado dramáticamente los resultados de los pacientes. Existe evidencia sólida de que el inicio temprano y el tratamiento sostenido con cisteamina son esenciales para retrasar la progresión a la enfermedad renal crónica (ERC) y el daño a los órganos afectados.

Actualmente, el diagnóstico de cistinosis se basa en la presencia de niveles elevados de cistina en los glóbulos blancos. Este método no es adecuado para NBS.

Atrofia muscular espinal (AME): La atrofia muscular espinal tiene una prevalencia de aproximadamente 1:10.000 nacidos vivos en Alemania. Se hereda de forma autosómica recesiva. Los recién nacidos con atrofia muscular espinal no presentan síntomas clínicos después del nacimiento.

La causa de la atrofia muscular espinal es una deleción del exón 7 en el gen SMN1, el gen que codifica la "proteína de la neurona motora de supervivencia". La deleción homocigótica carece de la proteína SMN funcional de la que dependen las células del asta anterior de la médula espinal. Los portadores heterocigotos son asintomáticos. La falta de la proteína SMN funcional produce daño a las neuronas motoras a nivel de la médula espinal, lo que lleva a una remodelación neurogénica severa y atrofia de los músculos esqueléticos.

Además del gen SMN1, los humanos tienen un "pseudogen" casi idéntico y ubicado adyacentemente, el gen SMN2. Se diferencia del gen SMN1 sólo en 5 pares de bases individuales. La proteína SMN2 no desempeña ningún papel en humanos sanos, ya que está presente suficiente proteína SMN1 funcional. El gen SMN2 contiene un interruptor molecular que puede detener completamente la expresión del gen. La variabilidad clínica de la atrofia muscular espinal se explica por la expresión diferencial de la proteína SMN2. Por tanto, la lectura del gen SMN2, incluido su exón 7, mediante la inhibición del interruptor de apagado representa un objetivo terapéutico para el tratamiento de pacientes con AME. La posibilidad de que una terapia influya positivamente en el curso de la enfermedad quedó demostrada en un estudio multicéntrico controlado con placebo con un oligonucleótido antisentido nusinersen (Spinraza®) de Ionis/Biogen en 2015/2016.

El diagnóstico de la enfermedad en casos de sospecha clínica se realiza mediante pruebas específicas de los genes SMN1 y SMN2 de la sangre con EDTA y del ADN aislado de la misma. La prueba generalmente se realiza en laboratorios de genética utilizando MLPA (amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple). Debido a que se requiere un kit comercial para cada muestra, la prueba es demasiado costosa para su detección como parte de la detección neonatal.

Procedimiento:

Población de estudio Los hospitales en Alemania son libres de elegir a cuál de los 11 laboratorios certificados envían las tarjetas de muestras de sangre seca para la detección de recién nacidos y si quieren participar en proyectos piloto.

En este proyecto, el laboratorio Becker & Kollegen de Múnich y el laboratorio de cribado de Hannover informan a sus remitentes sobre la posibilidad de añadir al cribado rutinario de recién nacidos el cribado genético de cistinosis (Hannover) o de cistinosis y AME (Munich).

La población de estudio incluye recién nacidos cuyos padres desean participar en el proyecto piloto y han otorgado su consentimiento informado por escrito. Se proporciona información adicional y una hoja de consentimiento para la detección de cistinosis y AME, que incluye una explicación del proceso y los objetivos de la detección, los beneficios esperados, las posibles consecuencias adversas de la no participación y la importancia de los resultados de la prueba. Se informa a los padres que se les informará sobre resultados normales y sin complicaciones solo cuando lo soliciten. El consentimiento debe documentarse con la firma de al menos uno de los padres y la firma del médico informante en el formulario de consentimiento. El formulario de consentimiento para el proyecto piloto también incluye el consentimiento para compartir información de contacto y hallazgos con un centro especializado en caso de un resultado de detección anormal.

En caso de resultado positivo, el laboratorio deberá informar primero al remitente y aclarar si el niño sigue hospitalizado. Si el niño aún se encuentra en tratamiento hospitalario, el remitente obtiene la información inicial de los padres y notifica a un experto para el diagnóstico correspondiente. Si el niño ya ha sido dado de alta del hospital, el laboratorio contacta directamente con el experto correspondiente (Cistinosis: Priv.-Doz. Dr. medicina. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; AME: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, Múnich).

Muestreo El cribado genético molecular se realiza utilizando la misma tarjeta de sangre seca (gotas de sangre en una tarjeta de papel de filtro) que la NBS de rutina. No se requiere extracción de sangre adicional. Si hay poco material disponible, primero se realiza la NBS regular, seguida de la detección de cistinosis y AME. Según la guía pediátrica, la muestra de sangre para el NBS debe recolectarse entre las 36 y 72 horas de vida.

En general, para todos los resultados no válidos (es decir, si la reacción de control falla) y para todos los resultados anormales, la prueba se repite internamente para confirmarla utilizando la muestra de sangre disponible. Si la calidad de la muestra de sangre es mala (por ejemplo, muy poca sangre), el laboratorio solicitará una nueva muestra de sangre. Si hay muy poco material para realizar la secuenciación de próxima generación requerida, el laboratorio también solicitará otra muestra de sangre seca.

Mediciones y métodos Cistinosis: para la detección de cistinosis, se realizó una PCR múltiple en la primera etapa para detectar las tres mutaciones CTNS más comunes en Alemania, es decir, una deleción de 57 kb (responsable de aproximadamente la mitad de las cistinosis en Europa y América del Norte) c.18_21delGACT, p. .T7Ffs*7 y c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Las muestras heterocigotas se someterán a una secuenciación de próxima generación basada en amplicones para detectar 101 mutaciones patógenas. Este enfoque predice una tasa de detección del 96,5%.

SMA La PCR triplex para las mutaciones CTNS descritas anteriormente se complementa con otra PCR que detecta el exón 7 en el gen SMN1. Con esta PCR cuádruplex se obtiene una señal específica para muestras normales (aquellas sin o con deleción heterocigótica del exón 7 en ambos alelos del gen SMN1). La detección de AME se considera positiva si se detecta una deleción homocigótica del exón 7 en el gen SMN1. La ausencia de amplificación por PCR indica la ausencia de una copia funcional de SMN1, es decir, un recién nacido afectado. Los individuos heterocigotos no pueden detectarse con este método. Tasa de detección, resultados falsos positivos y falsos negativos. Se supone una tasa de detección general de más del 95% para ambas enfermedades. Es poco probable que se obtengan resultados falsos negativos en las pruebas de detección. En la cistinosis, es posible obtener resultados falsos negativos debido a mutaciones raras previamente desconocidas o a pacientes que no portan ninguna de las tres mutaciones más comunes. En la AME, no se consideran los pacientes en los que se combina una deleción heterocigótica con una mutación puntual. En pacientes con síntomas de cistinosis o AME, se realizan más pruebas de diagnóstico independientemente del cribado.

También es muy poco probable que se obtengan resultados falsos positivos en las pruebas de detección. En la cistinosis, una muestra heterocigota puede aparecer falsamente como homocigota debido a una "abandono alélico" (fallo de la PCR de un alelo debido a mutaciones en la región de unión del cebador).

Confirmación del diagnóstico Cistinosis: en pacientes con una mutación homocigótica o heterocigótica compuesta en un gen CTNS, el diagnóstico se confirma determinando el nivel de cistina intraleucocítica en sangre con EDTA. Esta muestra se envía al laboratorio metabólico de Münster durante los primeros 14 días de vida.

AME: si el exón 7 en el gen SMN1 es homocigoto, se debe asumir AME (> 50% tipo I con el curso más severo). Para clasificar la gravedad de la AME, se requieren diagnósticos adicionales registrando el número de copias de SMN-2. El centro asistencial responsable enviará otra muestra de sangre al laboratorio de referencia de Ulm. Los resultados de la prueba de verificación se envían al laboratorio de selección para control de calidad.

Atención del niño afectado Cistinosis: Los niños con resultados positivos en la prueba de cistinosis son remitidos al centro de enfermedades metabólicas más cercano. La terapia con cisteamina se iniciará inmediatamente después de que se confirme el diagnóstico.

AME: Los niños con resultados positivos en el examen de AME son remitidos al Centro de Enfermedades Neuromusculares del Centro Social Pediátrico del Hospital Infantil Dr. von Hauner (Baviera) o a los Hospitales Universitarios de Essen y Münster.

Alcance del proyecto El proyecto se limitó inicialmente a 200.000 muestras, con posibilidad de ampliación.