Genetisches Neugeborenen-Screening auf Cystinose und spinale Muskelatrophie (GENESIS1)

Das bevölkerungsbasierte Neugeborenen-Screening (NBS) ist ein wichtiges öffentliches Gesundheitsprogramm, das den Verlauf mehrerer Krankheiten durch Früherkennung erheblich verbessert hat. Die Auswahl der untersuchten Störungen folgt im Allgemeinen den zehn von Wilson und Jungner dargelegten Prinzipien. In Deutschland ist NBS seit 1969 ein freiwilliges Programm des Nationalen Gesundheitsdienstes, das derzeit 17 Erkrankungen abdeckt. Aktuelle NBS-Methoden, die eine massenspektrometrische Tandemanalyse von getrockneten Blutflecken bei Neugeborenen verwenden, können viele potenziell behandelbare genetische Erkrankungen nicht erkennen. Gleichzeitig wird die molekularbasierte NBS zunehmend machbar, da DNA aus einem getrockneten Blutfleck extrahiert werden kann, die Sequenzierung der nächsten Generation wirtschaftlich geworden ist und die molekulare Diagnostik eine höhere Zuverlässigkeit und Gültigkeit aufweist, da genetische Datenbanken immer verfeinerter und umfassender werden. Nephropathische Cystinose und spinale Muskelatrophie (SMA) kommen für eine molekularbasierte NBS in Frage, da wirksame Therapien verfügbar sind.

Diese Studie soll eine wissenschaftliche Grundlage für das Neugeborenen-Screening auf Cystinose und SMA liefern und untersuchen, ob die Einbeziehung dieser Erkrankungen in das allgemeine Neugeborenen-Screening empfohlen werden sollte. Durch die Beobachtung identifizierter Säuglinge im Vergleich zu symptomatisch diagnostizierten Patienten außerhalb des Pilotprojekts werden wir feststellen, ob und inwieweit eine frühzeitige Diagnose und Therapieeinleitung zu einer günstigeren Prognose führt.

Cystinose: Cystinose ist eine seltene autosomal-rezessiv vererbte Systemerkrankung mit hoher Morbidität und Mortalität, die durch pathogene Varianten im CTNS-Gen verursacht wird, das den lysosomalen Cystintransporter Cystinosin kodiert und zur Ansammlung von Cystin im Lysosom führt. Die lebenslange Cystin-depletierende Therapie mit oralem Cysteamin, der einzigen spezifischen Therapie für Cystinose, hat zusammen mit der Verfügbarkeit einer Nierenersatztherapie im Kindesalter die Patientenergebnisse dramatisch verbessert. Es gibt belastbare Belege dafür, dass sowohl ein frühzeitiger Beginn als auch eine nachhaltige Therapie mit Cysteamin für die Verzögerung des Fortschreitens einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) und einer Schädigung der Endorgane von wesentlicher Bedeutung sind.

Derzeit basiert die Diagnose einer Cystinose auf dem Vorhandensein erhöhter Cystinwerte in den weißen Blutkörperchen. Diese Methode ist für NBS ungeeignet.

Spinale Muskelatrophie (SMA): Spinale Muskelatrophie hat in Deutschland eine Prävalenz von etwa 1:10.000 Lebendgeburten. Es wird autosomal-rezessiv vererbt. Neugeborene mit spinaler Muskelatrophie sind nach der Geburt ohne klinische Symptome.

Die Ursache der spinalen Muskelatrophie ist eine Deletion von Exon 7 im SMN1-Gen, dem kodierenden Gen für das „Survival Moto Neuron Protein“. Bei der homozygoten Deletion fehlt das funktionelle SMN-Protein, von dem die Vorderhornzellen im Rückenmark abhängen. Heterozygote Träger sind asymptomatisch. Das Fehlen des funktionellen SMN-Proteins führt zu einer Schädigung der Motoneuronen auf der Ebene des Rückenmarks, was zu einem schweren neurogenen Umbau und einer Atrophie der Skelettmuskulatur führt.

Zusätzlich zum SMN1-Gen besitzt der Mensch ein nahezu identisches, benachbart angeordnetes „Pseudo-Gen“, das SMN2-Gen. Es unterscheidet sich vom SMN1-Gen nur durch 5 einzelne Basenpaare. Beim gesunden Menschen spielt das SMN2-Protein keine Rolle, da ausreichend funktionsfähiges SMN1-Protein vorhanden ist. Das SMN2-Gen enthält einen molekularen Schalter, der die Expression des Gens vollständig unterbrechen kann. Die klinische Variabilität der spinalen Muskelatrophie wird durch die unterschiedliche Expression des SMN2-Proteins erklärt. Somit stellt das Auslesen des SMN2-Gens einschließlich seines Exon 7 durch Hemmung des Aus-Schalters ein therapeutisches Ziel für die Behandlung von SMA-Patienten dar. Die Möglichkeit einer Therapie zur positiven Beeinflussung des Krankheitsverlaufs wurde 2015/2016 in der placebokontrollierten Multicenterstudie mit einem Antisense-Oligonukleotid Nusinersen (Spinraza®) von Ionis/Biogen nachgewiesen.

Die Diagnose der Erkrankung erfolgt bei klinischem Verdacht durch gezielte Untersuchung der SMN1- und SMN2-Gene aus EDTA-Blut und daraus isolierter DNA. Der Test wird üblicherweise in Genlaboren mittels MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) durchgeführt. Da für jede Probe ein kommerzielles Kit erforderlich ist, ist der Test für ein Screening im Rahmen des Neugeborenenscreenings zu kostspielig.

Verfahren:

Studienpopulation Krankenhäuser in Deutschland können frei wählen, an welches der 11 zertifizierten Labore sie die Trockenblutkarten für das Neugeborenenscreening senden und ob sie an Pilotprojekten teilnehmen möchten.

In diesem Projekt informieren das Labor Becker & Kollegen in München und das Screening-Labor Hannover ihre Einsender über die Möglichkeit, das routinemäßig etablierte Neugeborenenscreening um das genetische Screening auf Cystinose (Hannover) bzw. Cystinose und SMA (München) zu erweitern.

Die Studienpopulation umfasst Neugeborene, deren Eltern am Pilotprojekt teilnehmen möchten und eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben haben. Es wird ein zusätzliches Informations- und Einverständnisformular für das Cystinose- und SMA-Screening bereitgestellt, das eine Erläuterung des Screening-Prozesses und der Screening-Ziele, des erwarteten Nutzens, möglicher nachteiliger Folgen einer Nichtteilnahme und der Bedeutung der Testergebnisse enthält. Die Eltern werden darüber informiert, dass ihnen normale, unauffällige Befunde nur auf Anfrage mitgeteilt werden. Die Einwilligung muss mit der Unterschrift mindestens eines Elternteils und der Unterschrift des informierenden Arztes auf der Einwilligungserklärung dokumentiert werden. Die Einwilligungserklärung für das Pilotprojekt beinhaltet auch die Einwilligung, im Falle eines auffälligen Screening-Ergebnisses Kontaktinformationen und Befunde an ein spezialisiertes Zentrum weiterzugeben.

Im Falle eines positiven Ergebnisses muss das Labor zunächst den Einsender informieren und klären, ob sich das Kind noch im Krankenhaus befindet. Befindet sich das Kind noch in stationärer Behandlung, holt der Einsender die ersten Informationen bei den Eltern ein und benachrichtigt einen Experten für die entsprechende Diagnose. Ist das Kind bereits aus dem Krankenhaus entlassen, kontaktiert das Labor direkt den entsprechenden Experten (Cystinose: Priv.-Doz. Dr. med. Katharina Hohenfellner, Rosenheim; SMA: Prof. Dr. med. Wolfgang Müller-Felber, München).

Probenahme Das molekulargenetische Screening wird unter Verwendung derselben Trockenblutkarte (Blutstropfen auf einer Filterpapierkarte) wie bei der routinemäßigen NBS durchgeführt. Es ist keine zusätzliche Blutentnahme erforderlich. Wenn nur wenig Material verfügbar ist, wird zunächst die reguläre NBS durchgeführt, gefolgt von einem Screening auf Cystinose und SMA. Gemäß der pädiatrischen Leitlinie sollte die Blutentnahme für die NBS zwischen 36 und 72 Lebensstunden erfolgen.

Im Allgemeinen wird der Test bei allen ungültigen Ergebnissen (d. h. wenn die Kontrollreaktion fehlschlägt) und bei allen abnormalen Ergebnissen intern zur Bestätigung anhand der verfügbaren Blutprobe wiederholt. Bei schlechter Qualität der Blutprobe (z. B. zu wenig Blut) wird das Labor eine neue Blutprobe anfordern. Sollte für die erforderliche Next-Generation-Sequenzierung nicht genügend Material vorhanden sein, wird das Labor zusätzlich eine weitere Trockenblutprobe anfordern.

Messungen und Methoden Cystinose: Für das Cystinose-Screening wurde im ersten Schritt eine Multiplex-PCR durchgeführt, um die drei häufigsten CTNS-Mutationen in Deutschland zu erkennen, d. h. eine 57-kb-Deletion (verantwortlich für etwa die Hälfte der Cystinose in Europa und Nordamerika) c.18_21delGACT, p .T7Ffs*7 und c.926dupG, p.S310Qfs*55 . Heterozygote Proben werden einer amplikonbasierten Next-Generation-Sequenzierung für 101 pathogene Mutationen unterzogen. Dieser Ansatz prognostiziert eine Erkennungsrate von 96,5 %.

SMA Die oben beschriebene Triplex-PCR für die CTNS-Mutationen wird durch eine weitere PCR ergänzt, die Exon 7 im SMN1-Gen nachweist. Mit dieser Quadruplex-PCR wird ein spezifisches Signal für normale Proben (solche ohne oder mit heterozygoter Exon-7-Deletion in beiden Allelen des SMN1-Gens) erhalten. Das SMA-Screening gilt als positiv, wenn im SMN1-Gen eine homozygote Exon-7-Deletion nachgewiesen wird. Das Fehlen einer PCR-Amplifikation weist auf das Fehlen einer funktionsfähigen SMN1-Kopie, d. h. auf ein betroffenes Neugeborenes, hin. Heterozygote Individuen können mit dieser Methode nicht erkannt werden. Erkennungsrate, falsch positive und falsch negative Ergebnisse. Für beide Krankheiten wird eine Gesamterkennungsrate von mehr als 95 % angenommen. Falsch negative Screening-Ergebnisse sind unwahrscheinlich. Bei der Cystinose sind falsch-negative Ergebnisse aufgrund bisher unbekannter seltener Mutationen oder aufgrund von Patienten, die keine der drei häufigsten Mutationen tragen, möglich. Bei SMA werden Patienten nicht berücksichtigt, bei denen eine heterozygote Deletion mit einer Punktmutation kombiniert ist. Bei Patienten mit Symptomen einer Cystinose oder SMA werden unabhängig vom Screening weitere diagnostische Untersuchungen durchgeführt.

Auch falsch positive Screening-Ergebnisse sind sehr unwahrscheinlich. Bei Cystinose kann eine heterozygote Probe aufgrund eines „Allel-Dropouts“ (PCR-Versagen eines Allels aufgrund von Mutationen in der Primer-Bindungsregion) fälschlicherweise als homozygot erscheinen.

Bestätigung der Diagnose Cystinose: Bei Patienten, bei denen eine homozygote oder zusammengesetzte heterozygote Mutation in einem CTNS-Gen festgestellt wurde, wird die Diagnose durch Bestimmung des intraleukozytären Cystinspiegels aus EDTA-Blut bestätigt. Diese Probe wird innerhalb der ersten 14 Lebenstage an das Stoffwechsellabor in Münster geschickt.

SMA: Wenn Exon 7 im SMN1-Gen homozygot ist, muss von SMA ausgegangen werden (> 50 % Typ I mit schwerstem Verlauf). Um den Schweregrad der SMA einzuordnen, ist eine weitere Diagnostik durch Erfassung der Anzahl der SMN-2-Kopien erforderlich. Eine weitere Blutprobe wird vom zuständigen Versorgungszentrum an das Referenzlabor in Ulm geschickt. Die Ergebnisse der Verifizierungstests werden zur Qualitätskontrolle an das Screening-Labor weitergeleitet.

Betreuung des betroffenen Kindes Cystinose: Kinder mit positivem Cystinose-Screening-Ergebnis werden an das nächstgelegene Zentrum für Stoffwechselerkrankungen überwiesen. Die Therapie mit Cysteamin wird unmittelbar nach Bestätigung der Diagnose begonnen.

SMA: Kinder mit positivem SMA-Screening-Ergebnis werden entweder an das Zentrum für Neuromuskuläre Erkrankungen im Sozialpädiatrischen Zentrum des Dr. von Hauner Kinderkrankenhauses (Bayern) oder an die Universitätskliniken Essen und Münster überwiesen.

Projektumfang Das Projekt war zunächst auf 200.000 Proben begrenzt, mit der Möglichkeit einer Erweiterung.