心血管疾患および神経疾患における単一細胞シーケンシングおよび多次元オミクス研究

臨床データ収集 臨床データ (名前、年齢、性別、体重/身長比 (BMI)、3 つのルーチン手順 (血液ルーチン、排便ルーチン、排尿ルーチン)、血液生化学、肝臓および腎臓の機能、凝固機能、ベッドサイド心電図、24-ホルター心電図、心臓カラードップラー超音波検査、頸動脈カラードップラー超音波検査、家族歴、既往歴、投薬歴、治療歴、個人歴など）を対象基準および対照を満たした患者から収集し、書面によるインフォームドコンセントに署名した。 。

1. 採血：血液検査、血液生化学、肝臓および腎臓の機能、凝固機能およびその他の検査のために、朝に実験集団から空腹時血液を5〜10ml採取します。
2. 糞便収集：午前6時から午前9時まで食事をとらずに実験集団の3〜5gの糞便を、日常の糞便および腸内細菌叢の検出のために収集する。 注: サンプルは 45 日以内に抗生物質やその他の薬物を摂取してはなりません。

3. 尿の採取：実験グループの朝の最初の尿を採取し、定期的な尿検査のために新鮮な中間尿 10 ～ 12 ml を保存します。

   上記で収集したサンプルをテストした後、テスト結果を対応する実験集団データに組み込みました。

単一細胞のシーケンス

1. サンプルの採取と処理 ① サンプルの採取：

   心房細動患者のサンプル収集:

   心房細動患者の外科的治療中に、少量の役に立たない左心耳組織 100mg がサンプルとして採取されました。 （この研究で使用された組織は残存組織または放棄された組織のいずれかであり、両方とも外科的切除に必要であったため、被験者に追加のリスクはありませんでした）

   心房細動制御心臓組織サンプルの収集:

   心房細動対照心臓組織は、心臓移植ドナーの心臓から切り取った廃棄組織100mgでした。

   頸動脈アテローム性動脈硬化症サンプルの収集:

   頸動脈アテローム性動脈硬化性プラーク動脈内膜切除術の外科的治療中に、廃棄された血管プラークの中心組織の少なくとも 1 mg がサンプルとして収集されました。

   頸動脈アテローム性動脈硬化症制御サンプルの収集:

   頸動脈アテローム性動脈硬化性プラーク動脈内膜切除術の外科的治療中に、廃棄された血管プラークの少なくとも 1 mg の辺縁組織が対照サンプルとして収集されました。

   もやもや病のサンプル採取：

   もやもや病に対する脳血管バイパス手術の際、少なくとも1mgの廃棄血管組織がサンプルとして採取されました。

   もやもや病対策サンプルの収集:

   非もやもや病患者の脳血管バイパス手術中に、少なくとも 1 mg の剪定された廃血管組織がサンプルとして収集されました。

   • サンプルの保存と配送: 現場での実験は事前に予約して調整する必要があり、臨床サンプルの収集には多くの不確実な要素があることを考慮します。 新しく採取したサンプルのほとんどには、Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008) が推奨されます。 新鮮な臓器および組織サンプルの保存用に最適化された保存溶液は、腫瘍、皮膚、心臓、脾臓、脳、骨格筋などのさまざまなヒトおよびマウスの組織でテストおよび検証されています。

   保存液の使用手順: a) 手術室または解剖学的構造から新鮮なサンプルを収集し、脂肪、毛髪、線維、壊死部分などの非標的組織を 10 分以内に素早く除去します。 b) 組織ブロックが大きい場合は、大豆サイズに分割して保存するか、バックアップ用に保存しておくことをお勧めします。 c) 組織ブロックが完全に覆われ、サンプル名がしっかりとマークされていることを確認するために、サンプルをあらかじめ冷却した (2 ～ 8℃) 組織保存溶液 (1.5 ml EP チューブ) に直接移します。 d) サンプルチューブをシーリングフィルムで密封し、発泡紙でサンプルをアイスパックから分離し、ジップロックバッグに入れ、アイスパックをできるだけ早く送るように手配します。 a) 組織保存溶液は 48 時間保存できます。 サンプルの品質を確保するため、物流便は翌日または翌朝に配達し、郵送物はサンプル日より前に配達する必要があります。 b) 完全に溶けるのを避けるため、またサンプルチューブとの直接接触によるサンプルの凍結を避けるために、十分な量のアイスパックを置くことをお勧めします。 c) 厚さ 3cm 以上の発泡ボックスを選択し、まず底にアイスパックをいくつか入れます。 d) サンプルチューブとアイスパックは発泡紙またはバブルバッグで分離する必要があります。保冷剤は事前に準備し、-80℃や-20℃から直接取り出すことは避けてください。低温により組織ブロックが凍結し、組織が損傷する可能性があります。

   ③ 消化：新鮮な心臓組織（コントロールの切り取り組織 100mg 以上、穿刺組織 3～4 個（16G 穿刺針、1.5cm））を 1～3mm3 の組織ブロックに切り刻み、DMEM の 15 ml EP チューブに移します。コラゲナーゼ I (450 U ML-1)、DNase I (60 U ML-1)、ヒアルロニダーゼ (60 U ML-1) を含みます。 37℃で1時間インキュベートし、HBB緩衝液（HBSS中2% FBSおよび0.2% BSA）を加えて消化を停止し、40 μmフィルターで50 mlコニカルチューブに濾過し、清潔な15 ml EPチューブに移し、 4℃、350gで5分間遠心分離します。 次いで、上清を除去し、粒子を1mlのACK溶解緩衝液(Gibco、A10492)に再懸濁し、室温で5分間消化した後、9mlのDMEMを添加した。 上清を遠心分離によって除去し、５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ中の２％ＦＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。

   ④ 選別：上記の条件で遠心分離を繰り返し、上清を除去し、細胞粒子を300μlの細胞懸濁緩衝液（0.04%BSA、1×PBS）と1μlのDRAQ5（Thermo Fisher Scientific、62251）に再懸濁した。および４，６－ジミニジン－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６４９０７）を加え、選別する前に５分間インキュベートする。 DRAQ5+/DAPI- 細胞を細胞再懸濁バッファーに収集します。 次いで、収集した細胞を上記のパラメータに従って再遠心分離し、細胞再懸濁緩衝液中に標的濃度1,000細胞μl-1まで再懸濁した。 血球計数器で細胞を計数し、必要に応じて濃度を調整します。

   ⑤ データベース構築：データベース構築に必要なすべての試薬は、10X Genomics Single Cell 3' Reagent Kits v2 キットまたは BD データベース構築キットに含まれています。