Sequenciamento de célula única e estudos ômicos multidimensionais em doenças cardiovasculares e neurológicas

Coleta de dados clínicos Dados clínicos (nome, idade, sexo, relação peso/altura (IMC), três procedimentos de rotina (rotina de sangue, rotina de fezes, rotina de urina), bioquímica sanguínea, função hepática e renal, função de coagulação, eletrocardiograma à beira do leito, 24- eletrocardiograma holter de uma hora, ultrassom Doppler colorido do coração, ultrassom Doppler colorido da carótida, história familiar, história pregressa, história de medicação, histórico de tratamento e história pessoal) foram coletados de pacientes que atenderam aos critérios de inclusão e controles etc.), assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido .

1. Coleta de sangue: Colete 5-10ml de sangue em jejum da população experimental pela manhã para rotina de sangue, bioquímica sanguínea, função hepática e renal, função de coagulação e outros testes.
2. Coleta de fezes: Serão coletadas 3-5g de fezes da população experimental sem alimentação no período das 6h às 9h para rotina de fezes e detecção da flora intestinal. Nota: A amostra não deve tomar antibióticos e outros medicamentos no prazo de 45 dias.

3. Coleta de urina: Colete a primeira urina do grupo experimental pela manhã e reserve 10-12ml de urina fresca para detecção de urina de rotina.

   Depois de testar as amostras coletadas acima, os resultados dos testes foram colocados nos dados populacionais experimentais correspondentes.

Sequenciamento de célula única

1. Coleta e processamento de amostras ① Coleta de amostras:

   Coleta de amostras de pacientes com fibrilação atrial:

   Uma pequena quantidade de tecido inútil do apêndice atrial esquerdo (100mg) foi coletada como amostra durante o tratamento cirúrgico de pacientes com fibrilação atrial. (O tecido utilizado neste estudo foi tecido residual ou tecido abandonado, e ambos foram necessários para ressecção cirúrgica, portanto não houve risco adicional para os sujeitos)

   Coleta de amostras de tecido cardíaco para controle de fibrilação atrial:

   O tecido cardíaco para controle da fibrilação atrial consistia em 100 mg de tecido residual cortado de coração de doador para transplante de coração.

   Coleta de amostras de aterosclerose carotídea:

   Durante o tratamento cirúrgico da endarterectomia com placa aterosclerótica carotídea, pelo menos 1mg do tecido central da placa vascular descartada foi coletado como amostra.

   Coleta de amostras de controle de aterosclerose carotídea:

   Durante o tratamento cirúrgico da endarterectomia por placa aterosclerótica carotídea, pelo menos 1 mg de tecido marginal de placa vascular descartada foi coletado como amostra controle.

   Coleta de amostras da doença de Moyamoya:

   Durante a cirurgia de bypass cerebrovascular para a doença de Moyamoya, pelo menos 1 mg de tecido vascular descartado foi coletado como amostra.

   Coleta de amostras de controle da doença de Moyamoya:

   Durante a cirurgia de bypass cerebrovascular em pacientes sem doença de moyamoya, pelo menos 1 mg de tecido vascular residual podado foi coletado como amostra.

   • Preservação e entrega de amostras: Considerando que os experimentos no local precisam ser agendados com antecedência e coordenados, e há muitos fatores incertos na coleta de amostras clínicas. Para a maioria das amostras recém-obtidas, recomenda-se Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Otimizada para o armazenamento de amostras frescas de órgãos e tecidos, a solução de preservação foi testada e validada em uma variedade de tecidos humanos e de camundongos, incluindo tumores, pele, coração, baço, cérebro e músculo esquelético.

   Procedimento para utilização da solução preservadora: a) Coletar amostras frescas da sala cirúrgica ou anatomia, e remover rapidamente tecidos não alvo como gordura, cabelos, fibras, partes necróticas, etc., em até 10 minutos; b) Se o bloco de tecido for grande, recomenda-se dividi-lo em tamanho de soja e guardá-lo ou guardá-lo para reserva; c) Transfira diretamente a amostra para a solução de preservação de tecido pré-resfriada (2-8 ℃) (tubo EP de 1,5 ml) para garantir que os blocos de tecido estejam completamente cobertos e o nome da amostra esteja bem marcado; d) Selar o tubo de amostra com filme vedante, separar a amostra da bolsa de gelo com papel espuma, colocar em um saco ziplock e providenciar a bolsa de gelo para ser enviada o mais rápido possível. a) A solução de armazenamento de tecidos pode ser armazenada por 48h. Para garantir a qualidade da amostra, a entrega logística deverá ser entregue no dia seguinte ou na manhã seguinte, e o envio deverá ser entregue antes da data da amostra. b) Recomenda-se colocar bolsas de gelo suficientes para evitar o derretimento completo e evitar o contato direto com o tubo de amostra, causando o congelamento da amostra; c) Selecione uma caixa de espuma com espessura não inferior a 3cm e coloque primeiro algumas bolsas de gelo no fundo; d) O tubo de amostra e a bolsa de gelo devem ser separados por papel de espuma ou saco plástico de bolhas; É necessário preparar a bolsa de gelo com antecedência e evitar retirá-la diretamente de -80 ℃ e -20 ℃, caso contrário o bloco de tecido congelará devido à baixa temperatura, resultando em danos aos tecidos.

   ③ Digestão: Tecido cardíaco fresco (não menos que 100 mg de tecido cortado de controle, 3-4 pedaços de tecido de punção (agulha de punção 16G, 1,5 cm)), cortado em blocos de tecido de 1 ~ 3 mm3 e transferido para tubos EP de 15 ml de DMEM contendo colagenase I (450 U ML-1), DNase I (60 U ML-1) e hialuronidase (60 U ML-1). Incubar a 37°C por 1 hora, depois adicionar tampão HBB (2% FBS e 0,2% BSA em HBSS) para interromper a digestão, filtrar através de um filtro de 40 µm em um tubo cônico de 50 ml, transferir para um tubo EP limpo de 15 ml e centrifugar a 4°C 350g por 5 min. O sobrenadante foi então removido e as partículas foram ressuspensas em 1 ml de tampão de lise ACK (Gibco, A10492), digerido à temperatura ambiente durante 5 minutos antes de serem adicionados 9 ml de DMEM. O sobrenadante foi removido por centrifugação e ressuspenso em 5 ml de tampão FACS (FBS a 2% e EDTA 2 mM, em PBS isento de cálcio/magnésio).

   ④ Classificação: A centrifugação foi repetida nas condições acima, o sobrenadante foi removido e as partículas celulares foram ressuspensas em 300 µl de tampão de suspensão celular (0,04% BSA, 1×PBS) e 1 µl de DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) e 4, 6-diaminidina - 2-fenilindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) e incubar durante 5 minutos antes de separar. As células DRAQ5+/DAPI- são coletadas em um tampão de ressuspensão celular. As células recolhidas foram então centrifugadas novamente de acordo com os parâmetros acima e ressuspensas num tampão de ressuspensão celular até uma concentração alvo de 1.000 células ul-1. As células são contadas com um contador de células sanguíneas e a concentração é ajustada conforme necessário.

   ⑤ Construção de banco de dados: Todos os reagentes necessários para a construção de banco de dados estão incluídos no kit 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 ou no kit de construção de banco de dados BD.