Секвенирование одиночных клеток и многомерные омические исследования сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний

Сбор клинических данных Клинические данные (имя, возраст, пол, соотношение веса и роста (ИМТ), три рутинные процедуры (анализ крови, стул, анализ мочи), биохимия крови, функция печени и почек, функция коагуляции, прикроватная электрокардиограмма, 24- часовая холтеровская электрокардиограмма, цветная допплерография сердца, цветная допплерография сонных артерий, семейный анамнез, анамнез, история приема лекарств, история лечения и личный анамнез) были собраны у пациентов, которые соответствовали критериям включения и контрольной группе и т. д.), подпишите письменное информированное согласие .

1. Сбор крови: утром возьмите 5–10 мл крови экспериментальной группы натощак для анализа крови, биохимии крови, функции печени и почек, функции свертывания крови и других тестов.
2. Сбор фекалий: 3-5 г фекалий экспериментальной группы без еды с 6:00 до 9:00 будут собираться для обычного анализа стула и выявления кишечной флоры. Примечание: испытуемый не должен принимать антибиотики и другие лекарства в течение 45 дней.

3. Сбор мочи: Соберите первую мочу экспериментальной группы утром и оставьте 10–12 мл свежей средней порции мочи для обычного анализа мочи.

   После тестирования образцов, собранных выше, результаты испытаний были внесены в соответствующие данные экспериментальной популяции.

Секвенирование одной клетки

1. Сбор и обработка проб ① Сбор проб:

   Выборка пациентов с фибрилляцией предсердий:

   Небольшое количество бесполезной ткани ушка левого предсердия (100 мг) было взято в качестве образца во время хирургического лечения пациентов с фибрилляцией предсердий. (Ткань, использованная в этом исследовании, представляла собой либо остаточную ткань, либо заброшенную ткань, и обе были необходимы для хирургической резекции, поэтому дополнительного риска для субъектов не было)

   Взятие образцов ткани сердца для контроля фибрилляции предсердий:

   Сердечная ткань для контроля фибрилляции предсердий представляла собой 100 мг отрезанной ткани донорского сердца, перенесшего трансплантат.

   Сбор образцов на атеросклероз сонных артерий:

   Во время хирургического лечения эндартерэктомии атеросклеротических бляшек сонной артерии в качестве образца собирали не менее 1 мг центральной ткани удаленной сосудистой бляшки.

   Сбор контрольных образцов при атеросклерозе сонных артерий:

   Во время хирургического лечения эндартерэктомии атеросклеротической бляшки сонной артерии в качестве контрольных образцов собирали не менее 1 мг маргинальной ткани удаленной сосудистой бляшки.

   Сбор образцов болезни Моямоя:

   Во время операции цереброваскулярного шунтирования по поводу болезни Моямоя в качестве образца было собрано не менее 1 мг выброшенной сосудистой ткани.

   Сбор проб для контроля болезни Моямоя:

   Во время операции цереброваскулярного шунтирования у пациентов, не страдающих болезнью Моямоя, в качестве образца собирали по меньшей мере 1 мг обрезанных отходов сосудистой ткани.

   • Сохранение и доставка образцов: учитывая, что эксперименты на месте необходимо бронировать заранее и координировать, а также существует множество неопределенных факторов при сборе клинических образцов. Для большинства свежеполученных образцов рекомендуется использовать MilteNY MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Консервационный раствор, оптимизированный для хранения свежих образцов органов и тканей, был протестирован и проверен на различных тканях человека и мышей, включая опухоли, кожу, сердце, селезенку, мозг и скелетные мышцы.

   Процедура использования консервационного раствора: а) Соберите свежие образцы из операционной или анатомического отдела и быстро удалите нецелевые ткани, такие как жир, волосы, волокна, некротические части и т. д., в течение 10 минут; б) Если блок ткани большой, рекомендуется разделить его на соевые бобы и сохранить или сохранить для резервного копирования; в) Непосредственно перенесите образец в предварительно охлажденный (2–8 ℃) раствор для консервации тканей (EP-пробирка объемом 1,5 мл), чтобы убедиться, что блоки ткани полностью покрыты и название образца хорошо обозначено; г) Запечатайте пробирку с образцом герметичной пленкой, отделите образец от пакета со льдом с помощью пенопластовой бумаги, поместите его в пакет с застежкой-молнией и организуйте отправку пакета со льдом как можно скорее. а) Раствор для хранения тканей можно хранить в течение 48 часов. Чтобы гарантировать качество образца, логистическая доставка должна быть доставлена ​​на следующий день или на следующее утро, а почтовое отправление должно быть доставлено до даты образца. б) Рекомендуется поместить достаточное количество пакетов со льдом, чтобы избежать полного таяния и прямого контакта с пробиркой для проб, приводящего к замерзанию пробы; в) Выберите пенопластовую коробку толщиной не менее 3 см и сначала положите на дно несколько пакетов со льдом; г) Пробирку для пробы и пакет со льдом следует разделить пенопластовой бумагой или пузырчатым мешком; Необходимо подготовить пакет со льдом заранее и не вынимать пакет со льдом непосредственно при температуре -80 ℃ и -20 ℃, иначе блок ткани замерзнет из-за низкой температуры, что приведет к повреждению тканей.

   ③ Пищеварение: свежая ткань сердца (не менее 100 мг контрольной отрезанной ткани, 3-4 кусочка пункционной ткани (пункционная игла 16G, 1,5 см)), нарезанная на блоки ткани объемом 1–3 мм3 и перенесенная в EP-пробирки объемом 15 мл с DMEM. содержащие коллагеназу I (450 ЕД ML-1), ДНКазу I (60 ЕД ML-1) и гиалуронидазу (60 ЕД ML-1). Инкубируйте при 37°C в течение 1 часа, затем добавьте буфер HBB (2% FBS и 0,2% BSA в HBSS), чтобы остановить расщепление, профильтруйте через фильтр 40 мкм в коническую пробирку емкостью 50 мл, перенесите в чистую EP-пробирку емкостью 15 мл и центрифуга при 4°С 350g 5 мин. Затем супернатант удаляли и частицы ресуспендировали в 1 мл лизирующего буфера ACK (Gibco, A10492), расщепляли при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем добавляли 9 мл DMEM. Супернатант удаляли центрифугированием и ресуспендировали в 5 мл буфера FACS (2% FBS и 2 мМ ЭДТА в PBS, не содержащем кальция/магния).

   ④ Сортировка: центрифугирование повторили в вышеуказанных условиях, надосадочную жидкость удалили, а клеточные частицы ресуспендировали в 300 мкл буфера для суспензии клеток (0,04% BSA, 1 × PBS) и 1 мкл DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251). и 4,6-диаминидин-2-фенилиндол (DAPI; BD Biosciences, 564907) и инкубируют в течение 5 минут перед сортировкой. Клетки DRAQ5+/DAPI- собирают в буфере для ресуспендирования клеток. Собранные клетки затем повторно центрифугировали в соответствии с вышеуказанными параметрами и ресуспендировали в буфере для ресуспендирования клеток до целевой концентрации 1000 клеток мкл-1. Клетки подсчитываются с помощью счетчика клеток крови, и концентрация корректируется по мере необходимости.

   ⑤ Создание базы данных: все реагенты, необходимые для создания базы данных, включены в набор реагентов 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 или набор для создания базы данных BD.