Enkeltcellesekvensering og multidimensjonale omics-studier i kardiovaskulære og nevrologiske sykdommer

Klinisk datainnsamling Kliniske data (navn, alder, kjønn, vekt/høyde-forhold (BMI), tre rutineprosedyrer (blodrutine, avføringsrutine, urinrutine), blodbiokjemi, lever- og nyrefunksjon, koagulasjonsfunksjon, elektrokardiogram ved sengekanten, 24- time holter-elektrokardiogram, hjertefarge-doppler-ultralyd, carotis-farge-doppler-ultralyd, familiehistorie, tidligere historie, medisinhistorie, behandlingshistorie og personlig historie) ble samlet inn fra pasienter som oppfylte inklusjonskriteriene og kontroller osv.), signere et skriftlig informert samtykke .

1. Blodprøvetaking: Samle 5-10ml fastende blod fra forsøkspopulasjonen om morgenen for blodrutine, blodbiokjemi, lever- og nyrefunksjon, koagulasjonsfunksjon og andre tester.
2. Avføringsoppsamling: 3-5 g avføring fra forsøkspopulasjonen uten å spise fra kl. 06.00 til 09.00 vil bli samlet inn for avføringsrutine og tarmfloradeteksjon. Merk: Prøven må ikke ta antibiotika og andre legemidler innen 45 dager.

3. Urinsamling: Samle opp den første urinen fra forsøksgruppen om morgenen, og reserver 10-12 ml frisk midstream-urin for rutinemessig urindeteksjon.

   Etter å ha testet prøvene samlet ovenfor, ble testresultatene lagt inn i de tilsvarende eksperimentelle populasjonsdataene.

Enkeltcellesekvensering

1. Prøveinnsamling og behandling ① Prøveinnsamling:

   Prøvesamling av pasienter med atrieflimmer:

   En liten mengde ubrukelig venstre atrie vedhengsvev 100 mg ble tatt som prøve under kirurgisk behandling av atrieflimmerpasienter. (Vevet som ble brukt i denne studien var enten restvev eller forlatt vev, og begge var nødvendige for kirurgisk reseksjon, så det var ingen ekstra risiko for forsøkspersonene)

   Atrieflimmerkontroll hjertevevsprøvesamling:

   Atrieflimmerkontrollhjertevev var 100 mg kuttet avfallsvev fra hjertetransplantasjonsdonorhjerte.

   Prøvesamling av carotis aterosklerose:

   Under kirurgisk behandling av karotis aterosklerotisk plakk-endarterektomi, ble minst 1 mg av det sentrale vevet av kassert vaskulær plakk samlet som en prøve.

   Carotis aterosklerose kontrollprøvesamling:

   Under kirurgisk behandling av karotis aterosklerotisk plakk-endarterektomi, ble minst 1 mg marginalt vev av kassert vaskulær plakk samlet inn som kontrollprøver.

   Samling av prøver fra Moyamoya sykdom:

   Under cerebrovaskulær bypass-operasjon for Moyamoyas sykdom ble minst 1 mg kassert vaskulært vev samlet inn som en prøve.

   Moyamoya sykdomskontrollprøvesamling:

   Under cerebrovaskulær bypass-operasjon hos pasienter med ikke-moyamoyasykdom, ble minst 1 mg beskåret avfallsvaskulært vev samlet inn som en prøve.

   • Prøvekonservering og levering: Tatt i betraktning at forsøk på stedet må bestilles på forhånd og koordineres, og det er mange usikre faktorer ved klinisk prøveinnsamling. For de fleste ferske prøvene anbefales Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Optimalisert for lagring av friske organ- og vevsprøver, har konserveringsløsningen blitt testet og validert på en rekke menneske- og musevev, inkludert svulster, hud, hjerte, milt, hjerne og skjelettmuskulatur.

   Prosedyre for bruk av konserveringsløsningen: a) Samle ferske prøver fra operasjonssalen eller anatomien, og fjern raskt ikke-målvev som fett, hår, fibre, nekrotiske deler osv. innen 10 minutter; b) Hvis vevsblokken er stor, anbefales det å dele den inn i soyastørrelse og lagre den eller beholde den for backup; c) Overfør prøven direkte til den forhåndsavkjølte (2-8 ℃) vevskonserveringsløsningen (1,5 ml EP-rør) for å sikre at vevsblokkene er fullstendig dekket og prøvenavnet er godt merket; d) Forsegl prøverøret med forseglingsfilm, separer prøven fra ispakken med skumpapir, legg den i en ziplock-pose, og ordne ispakken for å sendes så snart som mulig. a) Vevslagringsløsningen kan lagres i 48 timer. For å sikre kvaliteten på prøven bør logistikkleveransen leveres neste dag eller neste morgen, og forsendelsen skal leveres i forkant av prøvedatoen. b) Det anbefales å plassere nok isposer for å unngå fullstendig smelting, og for å unngå direkte kontakt med prøverøret som får prøven til å fryse; c) Velg en skumboks med en tykkelse på ikke mindre enn 3 cm, og legg noen isposer i bunnen først; d) Prøverøret og ispakken skal være atskilt med skumpapir eller boblepose; Det er nødvendig å forberede isposen på forhånd, og unngå å ta ut isposen direkte fra -80 ℃ og -20 ℃, ellers vil vevsblokken fryse på grunn av lav temperatur, noe som resulterer i vevsskade.

   ③ Fordøyelse: Ferskt hjertevev (ikke mindre enn 100 mg kontrollvev, 3-4 stykker punkteringsvev (16G punkteringsnål, 1,5 cm)), kuttet i 1~3 mm3 vevsblokker, og overført til 15 ml EP-rør med DMEM inneholdende kollagenase I (450 U ML-1), DNase I (60 U ML-1) og hyaluronidase (60 U ML-1). Inkuber ved 37 ° C i 1 time, tilsett deretter HBB-buffer (2 % FBS og 0,2 % BSA i HBSS) for å stoppe fordøyelsen, filtrer gjennom et 40 µm filter inn i et 50 ml konisk rør, overfør til et rent 15 ml EP-rør og sentrifuger ved 4 ° C 350 g i 5 min. Supernatanten ble deretter fjernet og partiklene ble resuspendert i 1 ml ACK-lysebuffer (Gibco, A10492), fordøyd ved romtemperatur i 5 minutter før 9 ml DMEM ble tilsatt. Supernatanten ble fjernet ved sentrifugering og resuspendert i 5 ml FACS-buffer (2 % FBS og 2 mM EDTA, i en kalsium/magnesiumfri PBS).

   ④ Sortering: Sentrifugering ble gjentatt under betingelsene ovenfor, supernatanten ble fjernet, og cellepartiklene ble resuspendert i 300 µl cellesuspensjonsbuffer (0,04% BSA, 1×PBS) og 1 µl DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) og 4,6-diaminidin - 2-fenylindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) og inkuber i 5 minutter før sortering. DRAQ5+/DAPI-celler samles i en celle-resuspensjonsbuffer. De oppsamlede cellene ble deretter sentrifugert på nytt i henhold til parametrene ovenfor og resuspendert i en celle-resuspensjonsbuffer til en målkonsentrasjon på 1000 celler ul-1. Cellene telles med en blodcelleteller og konsentrasjonen justeres etter behov.

   ⑤ Databasebygging: Alle reagenser som kreves for databasebygging er inkludert i 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 kit eller BD database building kit.