Sekwencjonowanie pojedynczych komórek i wielowymiarowe badania omiczne w chorobach sercowo-naczyniowych i neurologicznych

Zbieranie danych klinicznych Dane kliniczne (imię i nazwisko, wiek, płeć, stosunek masy ciała do wzrostu (BMI), trzy rutynowe procedury (analiza krwi, rutyna kału, rutyna moczu), biochemia krwi, czynność wątroby i nerek, funkcja krzepnięcia, elektrokardiogram przyłóżkowy, 24- godzinny elektrokardiogram holterowski, USG z kolorowym Dopplerem serca, USG z kolorowym Dopplerem tętnicy szyjnej, wywiad rodzinny, historia przeszłości, historia leków, historia leczenia i historia osobista) zebrano od pacjentów, którzy spełnili kryteria włączenia i byli grupą kontrolną itp.), podpisać pisemną świadomą zgodę .

1. Pobieranie krwi: Rano pobierz 5–10 ml krwi na czczo od populacji doświadczalnej w celu wykonania rutynowych badań krwi, biochemii krwi, czynności wątroby i nerek, funkcji krzepnięcia i innych badań.
2. Pobieranie kału: 3–5 g kału populacji doświadczalnej niejedzącej w godzinach od 6:00 do 9:00 zostanie pobranych w celu rutynowego badania stolca i wykrywania flory jelitowej. Uwaga: Próbka nie może przyjmować antybiotyków i innych leków w ciągu 45 dni.

3. Pobieranie moczu: Zbierz pierwszy mocz grupy eksperymentalnej rano i zachowaj 10-12 ml świeżego moczu ze środkowego strumienia do rutynowej diagnostyki moczu.

   Po zbadaniu próbek zebranych powyżej wyniki testu wprowadzono do odpowiednich danych populacji eksperymentalnej.

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek

1. Pobieranie i przetwarzanie próbek ① Pobieranie próbek:

   Pobieranie próbek od pacjentów z migotaniem przedsionków:

   Podczas leczenia chirurgicznego pacjentów z migotaniem przedsionków pobrano niewielką ilość bezużytecznej tkanki uszka lewego przedsionka (100 mg). (Tkanka wykorzystana w tym badaniu była tkanką resztkową lub porzuconą i obie były niezbędne do resekcji chirurgicznej, więc nie było dodatkowego ryzyka dla uczestników)

   Pobieranie próbek tkanki serca w celu kontroli migotania przedsionków:

   Tkankę serca kontrolującą migotanie przedsionków stanowiło 100 mg wyciętej tkanki odpadowej z serca dawcy przeszczepu serca.

   Pobieranie próbek w kierunku miażdżycy tętnic szyjnych:

   Podczas chirurgicznego leczenia endarterektomii blaszki miażdżycowej tętnicy szyjnej, pobrano jako próbkę co najmniej 1 mg tkanki centralnej usuniętej blaszki naczyniowej.

   Pobieranie próbek kontrolnych w kierunku miażdżycy tętnic szyjnych:

   Podczas chirurgicznego leczenia endarterektomii blaszki miażdżycowej tętnicy szyjnej, pobrano co najmniej 1 mg tkanki brzeżnej usuniętej blaszki naczyniowej jako próbki kontrolne.

   Pobieranie próbek choroby Moyamoya:

   Podczas operacji bajpasów mózgowo-naczyniowych z powodu choroby Moyamoya pobrano jako próbkę co najmniej 1 mg wyrzuconej tkanki naczyniowej.

   Pobieranie próbek do kontroli choroby Moyamoya:

   Podczas operacji bajpasów mózgowo-naczyniowych u pacjentów nie cierpiących na chorobę moyamoya pobrano jako próbkę co najmniej 1 mg oczyszczonej odpadowej tkanki naczyniowej.

   • Konserwacja i dostawa próbek: Biorąc pod uwagę, że eksperymenty na miejscu należy rezerwować z wyprzedzeniem i koordynować, a pobieranie próbek klinicznych wiąże się z wieloma niepewnymi czynnikami. W przypadku większości świeżo uzyskanych próbek zalecany jest roztwór Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Zoptymalizowany do przechowywania próbek świeżych narządów i tkanek, roztwór konserwujący został przetestowany i zatwierdzony na różnych tkankach ludzkich i mysich, w tym na nowotworach, skórze, sercu, śledzionie, mózgu i mięśniach szkieletowych.

   Procedura stosowania roztworu konserwującego: a) Pobrać świeże próbki z sali operacyjnej lub anatomii i szybko w ciągu 10 minut usunąć tkanki inne niż docelowe, takie jak tłuszcz, włosy, włókna, części martwicze itp.; b) Jeżeli blok tkanki jest duży, zaleca się podzielenie go na wielkość ziaren soi i zachowanie go lub zachowanie na zapas; c) Bezpośrednio przenieść próbkę do wstępnie schłodzonego (2–8°C) roztworu do konserwacji tkanek (probówka EP o pojemności 1,5 ml), aby upewnić się, że bloki tkanki są całkowicie pokryte, a nazwa próbki jest dobrze oznaczona; d) Zamknąć probówkę folią uszczelniającą, oddzielić próbkę od opakowania lodowego papierem piankowym, umieścić w torebce strunowej i przygotować worek lodowy do jak najszybszej wysyłki. a) Roztwór do przechowywania tkanek można przechowywać przez 48 godzin. Aby zapewnić jakość próbki, przesyłka logistyczna powinna zostać dostarczona następnego dnia lub następnego ranka, a wysyłka powinna zostać dostarczona przed datą próbki. b) Zaleca się umieszczenie wystarczającej ilości okładów z lodu, aby uniknąć całkowitego stopienia i bezpośredniego kontaktu z probówką, co mogłoby spowodować zamrożenie próbki; c) Wybierz pudełko z pianki o grubości nie mniejszej niż 3 cm, a na jego dno włóż najpierw kostki lodu; d) Probówkę i worek z lodem należy oddzielić papierem piankowym lub torebką bąbelkową; Należy wcześniej przygotować okład z lodem i unikać wyjmowania worka z lodem bezpośrednio z temperatur -80°C i -20°C, w przeciwnym razie blok tkanki zamarznie pod wpływem niskiej temperatury, co spowoduje uszkodzenie tkanki.

   ③ Trawienie: Świeża tkanka serca (nie mniej niż 100 mg przyciętej tkanki kontrolnej, 3-4 kawałki tkanki nakłuwającej (igła nakłuwająca 16G, 1,5 cm)), pocięta na bloki tkanki o objętości 1~3 mm3 i przeniesiona do probówek EP DMEM o pojemności 15 ml zawierający kolagenazę I (450 U ML-1), DNazę I (60 U ML-1) i hialuronidazę (60 U ML-1). Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, następnie dodać bufor HBB (2% FBS i 0,2% BSA w HBSS), aby zatrzymać trawienie, przesączyć przez filtr 40 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, przenieść do czystej probówki EP o pojemności 15 ml i wirować w 4°C 350g przez 5 min. Następnie usunięto supernatant i cząstki ponownie zawieszono w 1 ml buforu do lizy ACK (Gibco, A10492), trawiono w temperaturze pokojowej przez 5 minut, po czym dodano 9 ml DMEM. Supernatant usunięto przez odwirowanie i ponownie zawieszono w 5 ml buforu FACS (2% FBS i 2 mM EDTA, w PBS wolnym od wapnia i magnezu).

   ④ Sortowanie: Wirowanie powtórzono w powyższych warunkach, usunięto supernatant, a cząsteczki komórek ponownie zawieszono w 300 µl buforu do zawiesiny komórek (0,04% BSA, 1×PBS) i 1 µl DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) i 4,6-diaminidyno-2-fenyloindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) i inkubować przez 5 minut przed sortowaniem. Komórki DRAQ5+/DAPI- zbiera się w buforze do ponownego zawieszania komórek. Zebrane komórki następnie ponownie odwirowano zgodnie z powyższymi parametrami i ponownie zawieszono w buforze do ponownego zawieszania komórek do docelowego stężenia 1000 komórek ul-1. Komórki zlicza się za pomocą licznika krwinek i w razie potrzeby reguluje się stężenie.

   ⑤ Tworzenie bazy danych: Wszystkie odczynniki wymagane do tworzenia bazy danych znajdują się w zestawie 10X Genomics Single Cell 3 Reagent Kits v2 lub zestawie do tworzenia bazy danych BD.