Single Cell Sequencing en multidimensionale omics-studies bij hart- en neurologische ziekten

Verzameling van klinische gegevens Klinische gegevens (naam, leeftijd, geslacht, verhouding gewicht/lengte (BMI), drie routineprocedures (bloedroutine, stoelgangroutine, urineroutine), bloedbiochemie, lever- en nierfunctie, stollingsfunctie, elektrocardiogram aan het bed, 24- uur holter elektrocardiogram, hartkleuren Doppler-echografie, halsslagaderkleur Doppler-echografie, familiegeschiedenis, voorgeschiedenis, medicatiegeschiedenis, behandelgeschiedenis en persoonlijke geschiedenis) werden verzameld bij patiënten die voldeden aan de inclusiecriteria en controles enz.), een schriftelijke geïnformeerde toestemming ondertekenen .

1. Bloedafname: Verzamel 's ochtends 5-10 ml nuchter bloed van de experimentele populatie voor bloedroutine, bloedbiochemie, lever- en nierfunctie, stollingsfunctie en andere tests.
2. Fecale verzameling: 3-5 g ontlasting van de experimentele populatie zonder te eten van 6.00 uur tot 9.00 uur zal worden verzameld voor ontlastingsroutine en detectie van de darmflora. Let op: Het monster mag binnen 45 dagen geen antibiotica en andere medicijnen bevatten.

3. Urineverzameling: Verzamel 's ochtends de eerste urine van de experimentele groep en reserveer 10-12 ml verse middenstroomurine voor routinematige urinedetectie.

   Na het testen van de hierboven verzamelde monsters, werden de testresultaten in de overeenkomstige experimentele populatiegegevens geplaatst.

Sequentiebepaling van enkele cellen

1. Monsterafname en -verwerking ① Monsterafname:

   Monstername van patiënten met atriumfibrilleren:

   Een kleine hoeveelheid nutteloos weefsel van het linker atriumhartoor (100 mg) werd als monster genomen tijdens de chirurgische behandeling van patiënten met atriumfibrilleren. (Het weefsel dat in dit onderzoek werd gebruikt, was restweefsel of achtergelaten weefsel, en beide waren nodig voor chirurgische resectie, dus er was geen extra risico voor de proefpersonen)

   Atriale fibrillatie controle hartweefselmonsterafname:

   Het controlehartweefsel voor boezemfibrilleren bestond uit 100 mg afgesneden afvalweefsel van het hart van een harttransplantatiedonor.

   Monstername van carotis-atherosclerose:

   Tijdens de chirurgische behandeling van atherosclerotische plaque-endarterectomie van de halsslagader werd ten minste 1 mg van het centrale weefsel van de weggegooide vasculaire plaque als monster verzameld.

   Controlemonsterafname van carotis-atherosclerose:

   Tijdens de chirurgische behandeling van atherosclerotische plaque-endarterectomie van de halsslagader werd ten minste 1 mg marginaal weefsel van weggegooide vasculaire plaque verzameld als controlemonsters.

   Monstername van de ziekte van Moyamoya:

   Tijdens een cerebrovasculaire bypass-operatie voor de ziekte van Moyamoya werd ten minste 1 mg weggegooid vaatweefsel als monster verzameld.

   Moyamoya-ziektebestrijdingsmonsterverzameling:

   Tijdens een cerebrovasculaire bypass-operatie bij patiënten met de ziekte van Moyamoya werd ten minste 1 mg gesnoeid vaatafval als monster verzameld.

   • Bewaring en levering van monsters: Gezien het feit dat experimenten ter plaatse vooraf moeten worden geboekt en gecoördineerd, en er veel onzekere factoren zijn bij het verzamelen van klinische monsters. Voor de meeste vers verkregen monsters wordt Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008) aanbevolen. De conserveringsoplossing is geoptimaliseerd voor de opslag van verse orgaan- en weefselmonsters en is getest en gevalideerd op een verscheidenheid aan weefsels van mens en muis, waaronder tumoren, huid, hart, milt, hersenen en skeletspieren.

   Procedure voor het gebruik van de conserveringsoplossing: a) Verzamel verse monsters uit de operatiekamer of anatomie en verwijder snel niet-doelweefsel zoals vet, haar, vezels, necrotische delen, enz., binnen 10 minuten; b) Als het weefselblok groot is, wordt aanbevolen het in sojabonenformaat te verdelen en het op te slaan of te bewaren als back-up; c) Breng het monster rechtstreeks over naar de voorgekoelde (2-8℃) weefselconserveringsoplossing (EP-buis van 1,5 ml) om ervoor te zorgen dat de weefselblokken volledig bedekt zijn en dat de naam van het monster goed gemarkeerd is; d) Sluit het monsterbuisje af met afdichtingsfolie, scheid het monster van het ijspak met schuimpapier, doe het in een ritssluitingszak en zorg ervoor dat het ijspak zo snel mogelijk wordt verzonden. a) De weefselopslagoplossing kan 48 uur worden bewaard. Om de kwaliteit van het monster te garanderen, moet de logistieke levering de volgende dag of de volgende ochtend worden afgeleverd en moet de mailing vóór de monsterdatum worden afgeleverd. b) Het wordt aanbevolen om voldoende ijspakketten te plaatsen om volledig smelten te voorkomen en om direct contact met het monsterbuisje te vermijden, waardoor het monster kan bevriezen; c) Selecteer een doos van schuimrubber met een dikte van niet minder dan 3 cm en plaats eerst enkele ijspakketten op de bodem; d) Het monsterbuisje en het ijspak moeten worden gescheiden door schuimpapier of een bellenzak; Het is noodzakelijk om het ijspak van tevoren klaar te maken en te voorkomen dat u de ijszak rechtstreeks van -80 ℃ en -20 ℃ haalt, anders zal het weefselblok bevriezen als gevolg van lage temperaturen, wat resulteert in weefselbeschadiging.

   ③ Spijsvertering: Vers hartweefsel (niet minder dan 100 mg controleweefsel, 3-4 stukjes prikweefsel (16G priknaald, 1,5 cm)), in weefselblokken van 1 ~ 3 mm3 gesneden en overgebracht naar EP-buizen van 15 ml DMEM met collagenase I (450 U ML-1), DNase I (60 U ML-1) en hyaluronidase (60 U ML-1). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, voeg vervolgens HBB-buffer (2% FBS en 0,2% BSA in HBSS) toe om de spijsvertering te stoppen, filtreer door een filter van 40 µm in een conische buis van 50 ml, breng over naar een schone EP-buis van 15 ml en centrifugeer bij 4 ° C 350 g gedurende 5 minuten. Het supernatant werd vervolgens verwijderd en de deeltjes werden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml ACK-lysebuffer (Gibco, A10492), gedigereerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voordat 9 ml DMEM werd toegevoegd. Het supernatant werd verwijderd door centrifugatie en opnieuw gesuspendeerd in 5 ml FACS-buffer (2% FBS en 2 mM EDTA, in een calcium/magnesiumvrije PBS).

   ④ Sorteren: Het centrifugeren werd herhaald onder de bovengenoemde omstandigheden, het supernatant werd verwijderd en de celdeeltjes werden opnieuw gesuspendeerd in 300 µl celsuspensiebuffer (0,04% BSA, 1 x PBS) en 1 µl DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) en 4,6-diaminidine-2-fenylindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) en incubeer gedurende 5 minuten vóór het sorteren. DRAQ5+/DAPI-cellen worden verzameld in een celhersuspensiebuffer. De verzamelde cellen werden vervolgens opnieuw gecentrifugeerd volgens de bovenstaande parameters en opnieuw gesuspendeerd in een celhersuspensiebuffer tot een doelconcentratie van 1000 cellen ul-1. Met een bloedcellenteller worden de cellen geteld en indien nodig wordt de concentratie aangepast.

   ⑤ Databaseopbouw: alle reagentia die nodig zijn voor het bouwen van een database zijn inbegrepen in de 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2-kit of de BD-databasebouwkit.