Jednobuněčné sekvenování a multidimenzionální Omics studie u kardiovaskulárních a neurologických onemocnění

Sběr klinických údajů Klinické údaje (jméno, věk, pohlaví, poměr váha/výška (BMI), tři rutinní postupy (krevní rutina, rutina stolice, rutina moči), biochemie krve, funkce jater a ledvin, koagulační funkce, elektrokardiogram u lůžka, 24- hodinový holterový elektrokardiogram, dopplerovský ultrazvuk barvy srdce, dopplerovský ultrazvuk karotid, rodinná anamnéza, anamnéza, anamnéza léků, historie léčby a osobní anamnéza) byly shromážděny od pacientů, kteří splnili kritéria pro zařazení a kontroly atd.), podepsat písemný informovaný souhlas .

1. Odběr krve: Odběr 5-10 ml krve nalačno od experimentální populace ráno pro vyšetření krve, biochemie krve, funkce jater a ledvin, koagulační funkce a další testy.
2. Sběr stolice: 3-5 g stolice experimentální populace bez jídla od 6:00 do 9:00 bude odebráno pro rutinní stolici a detekci střevní flóry. Upozornění: Vzorek nesmí po dobu 45 dnů zabrat antibiotika a jiné léky.

3. Sběr moči: Odeberte první moč experimentální skupiny ráno a ponechte si 10-12 ml čerstvé střední moči pro rutinní detekci moči.

   Po testování vzorků shromážděných výše byly výsledky testu vloženy do odpovídajících experimentálních populačních dat.

Jednobuněčné sekvenování

1. Odběr a zpracování vzorků ① Odběr vzorků:

   Vzorový soubor pacientů s fibrilací síní:

   Malé množství nepotřebné tkáně ouška levé síně 100 mg bylo odebráno jako vzorek při chirurgické léčbě pacientů s fibrilací síní. (Tkáň použitá v této studii byla buď zbytková tkáň nebo opuštěná tkáň a obě byly nezbytné pro chirurgickou resekci, takže pro subjekty neexistovalo žádné další riziko)

   Odběr vzorků srdeční tkáně pro kontrolu fibrilace síní:

   Kontrolní srdeční tkáň fibrilace síní byla 100 mg odříznuté odpadní tkáně ze srdce dárce po transplantaci srdce.

   Sbírka vzorků aterosklerózy karotid:

   Během chirurgické léčby endarterektomie karotického aterosklerotického plátu byl odebrán jako vzorek alespoň 1 mg centrální tkáně vyřazeného vaskulárního plátu.

   Sbírka kontrolních vzorků aterosklerózy karotid:

   Během chirurgické léčby endarterektomie karotického aterosklerotického plátu byl odebrán alespoň 1 mg okrajové tkáně vyřazeného vaskulárního plátu jako kontrolní vzorky.

   Sbírka vzorků nemoci Moyamoya:

   Během cerebrovaskulárního bypassu pro Moyamoyovu chorobu byl jako vzorek odebrán alespoň 1 mg vyřazené cévní tkáně.

   Sbírka vzorků kontroly onemocnění Moyamoya:

   Během operace cerebrovaskulárního bypassu u pacientů bez moyamoya byl odebrán jako vzorek alespoň 1 mg oříznuté odpadní vaskulární tkáně.

   • Uchování a dodání vzorků: Vzhledem k tomu, že experimenty na místě je třeba rezervovat předem a koordinovat, a že při odběru klinických vzorků existuje mnoho nejistých faktorů. Pro většinu čerstvě získaných vzorků se doporučuje Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Konzervační roztok, optimalizovaný pro skladování čerstvých vzorků orgánů a tkání, byl testován a ověřen na různých lidských a myších tkáních, včetně nádorů, kůže, srdce, sleziny, mozku a kosterního svalstva.

   Postup použití konzervačního roztoku: a) Odeberte čerstvé vzorky z operačního sálu nebo anatomie a během 10 minut rychle odstraňte necílové tkáně, jako je tuk, vlasy, vlákna, nekrotické části atd.; b) Pokud je tkáňový blok velký, doporučuje se rozdělit jej na velikost sójových bobů a uložit nebo uložit pro zálohu; c) Přímo přeneste vzorek do předem vychlazeného (2-8 °C) roztoku pro uchování tkáně (1,5 ml EP zkumavka), aby bylo zajištěno, že tkáňové bloky jsou zcela pokryty a název vzorku je dobře označen; d) Uzavřete zkumavku se vzorkem těsnící fólií, oddělte vzorek od ledového obalu pěnovým papírem, vložte jej do zipového sáčku a zajistěte odeslání ledového obalu co nejdříve. a) Tkáňový skladovací roztok lze skladovat 48 hodin. Aby byla zajištěna kvalita vzorku, měla by být logistická dodávka doručena následující den nebo druhý den ráno a zásilka by měla být doručena před datem vzorku. b) Doporučuje se umístit dostatečné množství ledových sáčků, aby se zabránilo úplnému roztavení a aby se zabránilo přímému kontaktu se zkumavkou se vzorkem, který způsobí zamrznutí vzorku; c) Vyberte pěnovou krabici o tloušťce ne menší než 3 cm a na její dno vložte nejprve několik sáčků s ledem; d) Zkumavka se vzorkem a sáček s ledem by měly být odděleny pěnovým papírem nebo bublinkovým sáčkem; Ledový sáček je nutné připravit předem a vyvarovat se vyjímání ledového sáčku přímo z teploty -80°C a -20°C, jinak tkáňový blok zmrzne vlivem nízké teploty, což má za následek poškození tkáně.

   ③ Trávení: Čerstvá srdeční tkáň (ne méně než 100 mg kontrolní oříznuté tkáně, 3–4 kusy punkční tkáně (16G punkční jehla, 1,5 cm)), nasekaná na tkáňové bloky 1~3 mm3 a přenesená do 15ml EP zkumavek DMEM obsahující kolagenázu I (450 U ML-1), DNázu I (60 U ML-1) a hyaluronidázu (60 U ML-1). Inkubujte při 37 °C po dobu 1 hodiny, poté přidejte HBB pufr (2 % FBS a 0,2 % BSA v HBSS), aby se zastavilo štěpení, přefiltrujte přes 40 µm filtr do 50 ml kónické zkumavky, přeneste do čisté 15 ml EP zkumavky a centrifugujte při 4°C 350g po dobu 5 min. Supernatant byl poté odstraněn a částice byly resuspendovány v 1 ml ACK lyzačního pufru (Gibco, A10492), štěpeny při teplotě místnosti po dobu 5 minut, než bylo přidáno 9 ml DMEM. Supernatant byl odstraněn centrifugací a resuspendován v 5 ml FACS pufru (2% FBS a 2mM EDTA, v PBS bez vápníku/hořčíku).

   ④ Třídění: Centrifugace byla opakována za výše uvedených podmínek, supernatant byl odstraněn a buněčné částice byly resuspendovány ve 300 ul buněčného suspenzního pufru (0,04%BSA, 1×PBS) a 1 ul DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) a 4,6-diaminidin-2-fenylindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) a před tříděním inkubujte po dobu 5 minut. Buňky DRAQ5+/DAPI- se shromáždí v pufru pro resuspenzi buněk. Shromážděné buňky byly poté znovu odstředěny podle výše uvedených parametrů a resuspendovány v pufru pro resuspenzi buněk na cílovou koncentraci 1000 buněk ul-1. Buňky se spočítají počítadlem krevních buněk a koncentrace se upraví podle potřeby.

   ⑤ Vytvoření databáze: Všechna činidla potřebná pro vytvoření databáze jsou zahrnuta v sadě 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 kit nebo v sadě pro vytváření databáze BD.