Einzelzellsequenzierung und mehrdimensionale Omics-Studien bei kardiovaskulären und neurologischen Erkrankungen

Klinische Datenerfassung Klinische Daten (Name, Alter, Geschlecht, Gewichts-/Größenverhältnis (BMI), drei Routineverfahren (Blutuntersuchung, Stuhluntersuchung, Urinuntersuchung), Blutbiochemie, Leber- und Nierenfunktion, Gerinnungsfunktion, Elektrokardiogramm am Krankenbett, 24- (Stunden-Holter-Elektrokardiogramm, Herz-Farb-Doppler-Ultraschall, Karotis-Farb-Doppler-Ultraschall, Familienanamnese, Vorgeschichte, Medikamentenanamnese, Behandlungsanamnese und persönliche Anamnese) wurden von Patienten gesammelt, die die Einschlusskriterien und Kontrollen usw. erfüllten. Unterzeichnen Sie eine schriftliche Einverständniserklärung .

1. Blutentnahme: Nehmen Sie morgens 5-10 ml Nüchternblut aus der Versuchspopulation für Blutuntersuchungen, Blutbiochemie, Leber- und Nierenfunktion, Gerinnungsfunktion und andere Tests.
2. Kotsammlung: 3–5 g Kot der Versuchspopulation ohne Nahrungsaufnahme zwischen 6 und 9 Uhr werden für die Stuhlroutine und den Nachweis der Darmflora gesammelt. Hinweis: Die Probe darf innerhalb von 45 Tagen keine Antibiotika und andere Medikamente einnehmen.

3. Urinsammlung: Sammeln Sie morgens den ersten Urin der Versuchsgruppe und reservieren Sie 10–12 ml frischen Mittelstrahlurin für die routinemäßige Urinerkennung.

   Nach dem Testen der oben gesammelten Proben wurden die Testergebnisse in die entsprechenden experimentellen Populationsdaten eingefügt.

Einzelzellsequenzierung

1. Probenentnahme und -verarbeitung ① Probenentnahme:

   Probenentnahme von Patienten mit Vorhofflimmern:

   Bei der chirurgischen Behandlung von Patienten mit Vorhofflimmern wurde eine kleine Menge unbrauchbares Gewebe des linken Vorhofohrs (100 mg) als Probe entnommen. (Das in dieser Studie verwendete Gewebe war entweder Restgewebe oder aufgegebenes Gewebe, und beides war für die chirurgische Resektion erforderlich, sodass für die Probanden kein zusätzliches Risiko bestand.)

   Entnahme von Herzgewebeproben zur Kontrolle von Vorhofflimmern:

   Das Vorhofflimmern-Kontrollherzgewebe bestand aus 100 mg geschnittenem Abfallgewebe aus dem Herzen eines Spenderherzens nach einer Herztransplantation.

   Probenentnahme bei Karotis-Atherosklerose:

   Während der chirurgischen Behandlung der Endarteriektomie von atherosklerotischem Karotisplaque wurde mindestens 1 mg des Zentralgewebes von verworfenem Gefäßplaque als Probe entnommen.

   Probenentnahme zur Kontrolle der Karotis-Atherosklerose:

   Während der chirurgischen Behandlung der Endarteriektomie von atherosklerotischem Karotisplaque wurde mindestens 1 mg Randgewebe von verworfenem Gefäßplaque als Kontrollproben entnommen.

   Probensammlung der Moyamoya-Krankheit:

   Während einer zerebrovaskulären Bypass-Operation wegen der Moyamoya-Krankheit wurde mindestens 1 mg entsorgtes Gefäßgewebe als Probe entnommen.

   Probenentnahme zur Bekämpfung der Moyamoya-Krankheit:

   Während einer zerebrovaskulären Bypass-Operation bei Patienten ohne Moyamoya-Krankheit wurde mindestens 1 mg beschnittenes Gefäßabfallgewebe als Probe entnommen.

   • Probenaufbewahrung und -lieferung: In Anbetracht der Tatsache, dass Vor-Ort-Experimente im Voraus gebucht und koordiniert werden müssen und es bei der klinischen Probenentnahme viele Unsicherheitsfaktoren gibt. Für die meisten frisch entnommenen Proben wird Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008) empfohlen. Die für die Lagerung frischer Organ- und Gewebeproben optimierte Konservierungslösung wurde an verschiedenen Geweben von Menschen und Mäusen getestet und validiert, darunter Tumoren, Haut, Herz, Milz, Gehirn und Skelettmuskel.

   Verfahren zur Verwendung der Konservierungslösung: a) Sammeln Sie frische Proben aus dem Operationssaal oder der Anatomie und entfernen Sie schnell und innerhalb von 10 Minuten Nichtzielgewebe wie Fett, Haare, Fasern, nekrotische Teile usw.; b) Wenn der Gewebeblock groß ist, empfiehlt es sich, ihn in Sojabohnengröße aufzuteilen und aufzubewahren oder zur Sicherung aufzubewahren; c) Übertragen Sie die Probe direkt in die vorgekühlte (2-8℃) Gewebekonservierungslösung (1,5-ml-EP-Röhrchen), um sicherzustellen, dass die Gewebeblöcke vollständig bedeckt sind und der Probenname gut markiert ist. d) Verschließen Sie das Probenröhrchen mit einer Versiegelungsfolie, trennen Sie die Probe mit Schaumstoffpapier vom Eisbeutel, stecken Sie sie in einen Druckverschlussbeutel und veranlassen Sie den Versand des Eisbeutels so schnell wie möglich. a) Die Gewebeaufbewahrungslösung kann 48 Stunden lang gelagert werden. Um die Qualität der Probe sicherzustellen, sollte die Logistiklieferung am nächsten Tag oder am nächsten Morgen zugestellt werden und die Postsendung sollte vor dem Probentermin zugestellt werden. b) Es wird empfohlen, genügend Eisbeutel zu platzieren, um ein vollständiges Schmelzen zu vermeiden und einen direkten Kontakt mit dem Probenröhrchen zu vermeiden, der zum Einfrieren der Probe führen würde. c) Wählen Sie eine Schaumstoffbox mit einer Dicke von mindestens 3 cm und legen Sie zuerst einige Eisbeutel in den Boden. d) Das Probenröhrchen und der Eisbeutel sollten durch Schaumstoffpapier oder einen Luftpolsterbeutel getrennt sein. Es ist notwendig, den Eisbeutel im Voraus vorzubereiten und den Eisbeutel nicht direkt aus -80℃ und -20℃ herauszunehmen, da sonst der Gewebeblock aufgrund der niedrigen Temperatur gefriert, was zu Gewebeschäden führt.

   ③ Verdauung: Frisches Herzgewebe (nicht weniger als 100 mg geschnittenes Kontrollgewebe, 3–4 Stück Punktionsgewebe (16G-Punktionsnadel, 1,5 cm)), in 1–3 mm3 große Gewebeblöcke geschnitten und in 15-ml-EP-Röhrchen mit DMEM überführt Enthält Kollagenase I (450 U ML-1), DNase I (60 U ML-1) und Hyaluronidase (60 U ML-1). 1 Stunde bei 37 °C inkubieren, dann HBB-Puffer (2 % FBS und 0,2 % BSA in HBSS) hinzufügen, um die Verdauung zu stoppen, durch einen 40-µm-Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen filtrieren, in ein sauberes 15-ml-EP-Röhrchen überführen und 5 Min. bei 4°C 350g zentrifugieren. Der Überstand wurde dann entfernt und die Partikel wurden in 1 ml ACK-Lysepuffer (Gibco, A10492) resuspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur verdaut, bevor 9 ml DMEM hinzugefügt wurden. Der Überstand wurde durch Zentrifugation entfernt und in 5 ml FACS-Puffer (2 % FBS und 2 mM EDTA, in kalzium-/magnesiumfreiem PBS) resuspendiert.

   ④ Sortierung: Die Zentrifugation wurde unter den oben genannten Bedingungen wiederholt, der Überstand wurde entfernt und die Zellpartikel wurden in 300 µl Zellsuspensionspuffer (0,04 % BSA, 1×PBS) und 1 µl DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) resuspendiert. und 4,6-Diaminidin – 2-Phenylindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) und vor dem Sortieren 5 Minuten lang inkubieren. DRAQ5+/DAPI- Zellen werden in einem Zellresuspensionspuffer gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden dann gemäß den oben genannten Parametern erneut zentrifugiert und in einem Zell-Resuspensionspuffer auf eine Zielkonzentration von 1.000 Zellen ul-1 resuspendiert. Die Zellen werden mit einem Blutzellenzähler gezählt und die Konzentration je nach Bedarf angepasst.

   ⑤ Datenbankaufbau: Alle für den Datenbankaufbau erforderlichen Reagenzien sind im 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 Kit oder im BD Database Building Kit enthalten.