Enkeltcellesekvensering og multidimensionelle omics-undersøgelser i kardiovaskulære og neurologiske sygdomme

Indsamling af kliniske data Kliniske data (navn, alder, køn, vægt/højde-forhold (BMI), tre rutineprocedurer (blodrutine, afføringsrutine, urinrutine), blodbiokemi, lever- og nyrefunktion, koagulationsfunktion, elektrokardiogram ved sengekanten, 24- time holter elektrokardiogram, hjertefarve Doppler ultralyd, carotis farve Doppler ultralyd, familiehistorie, tidligere historie, medicinhistorie, behandlingshistorie og personlig historie) blev indsamlet fra patienter, der opfyldte inklusionskriterierne og kontroller osv.), underskrive et skriftligt informeret samtykke .

1. Blodopsamling: Saml 5-10 ml fastende blod fra forsøgspopulationen om morgenen til blodrutine, blodbiokemi, lever- og nyrefunktion, koagulationsfunktion og andre tests.
2. Fækal opsamling: 3-5 g fæces af forsøgspopulationen uden at spise fra kl. 06.00 til kl. 9.00 vil blive indsamlet til afføringsrutine og påvisning af tarmflora. Bemærk: Prøven må ikke tage antibiotika og andre lægemidler inden for 45 dage.

3. Urinopsamling: Saml den første urin fra forsøgsgruppen om morgenen, og reserver 10-12 ml frisk midstream-urin til rutinemæssig urindetektion.

   Efter at have testet prøverne indsamlet ovenfor, blev testresultaterne sat ind i de tilsvarende eksperimentelle populationsdata.

Enkeltcelle sekventering

1. Prøveindsamling og -behandling ① Prøveindsamling:

   Prøveindsamling af patienter med atrieflimren:

   En lille mængde ubrugelig venstre atrielt vedhængsvæv 100 mg blev taget som en prøve under kirurgisk behandling af patienter med atrieflimren. (Vævet anvendt i denne undersøgelse var enten restvæv eller forladt væv, og begge var nødvendige for kirurgisk resektion, så der var ingen yderligere risiko for forsøgspersonerne)

   Indsamling af hjertevævsprøver til kontrol af atrieflimren:

   Atrieflimren kontrolhjertevæv var 100 mg afskåret affaldsvæv fra hjertetransplantationsdonorhjerte.

   Prøveindsamling af carotis aterosklerose:

   Under den kirurgiske behandling af carotis aterosklerotisk plaque-endarterektomi blev mindst 1 mg af det centrale væv af kasseret vaskulær plak opsamlet som en prøve.

   Indsamling af carotis aterosklerose kontrolprøve:

   Under den kirurgiske behandling af carotis aterosklerotisk plaque-endarterektomi blev mindst 1 mg marginalt væv af kasseret vaskulær plak opsamlet som kontrolprøver.

   Prøvesamling af Moyamoya sygdom:

   Under cerebrovaskulær bypass-operation for Moyamoyas sygdom blev mindst 1 mg kasseret vaskulært væv opsamlet som en prøve.

   Prøveindsamling af Moyamoya sygdomsbekæmpelse:

   Under cerebrovaskulær bypass-operation hos ikke-moyamoya-sygdomspatienter blev mindst 1 mg beskåret affaldsvaskulært væv indsamlet som en prøve.

   • Prøvebevaring og levering: I betragtning af, at forsøg på stedet skal bookes på forhånd og koordineres, og der er mange usikre faktorer i klinisk prøveindsamling. Til de fleste friske prøver anbefales Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Optimeret til opbevaring af friske organ- og vævsprøver er konserveringsopløsningen blevet testet og valideret på en række menneske- og musevæv, herunder tumorer, hud, hjerte, milt, hjerne og skeletmuskulatur.

   Fremgangsmåde for brug af konserveringsopløsningen: a) Saml friske prøver fra operationsstuen eller anatomien, og fjern hurtigt ikke-målvæv såsom fedt, hår, fibre, nekrotiske dele osv. inden for 10 minutter; b) Hvis vævsblokken er stor, anbefales det at opdele den i sojastørrelse og gemme den eller beholde den til backup; c) Overfør prøven direkte til den forafkølede (2-8℃) vævskonserveringsopløsning (1,5 ml EP-rør) for at sikre, at vævsblokkene er fuldstændigt dækket, og prøvenavnet er godt markeret; d) Forsegl prøverøret med forseglingsfilm, adskil prøven fra isposen med skumpapir, læg den i en lynlåspose, og sørg for, at isposen sendes hurtigst muligt. a) Vævsopløsningen kan opbevares i 48 timer. For at sikre kvaliteten af ​​prøven skal logistikleverancen afleveres næste dag eller næste morgen, og forsendelsen skal afleveres før prøvedatoen. b) Det anbefales at placere nok isposer for at undgå fuldstændig smeltning og for at undgå direkte kontakt med prøverøret, hvilket får prøven til at fryse; c) Vælg en skumboks med en tykkelse på ikke mindre end 3 cm, og læg nogle isposer i bunden først; d) Prøverøret og isposen skal adskilles med skumpapir eller boblepose; Det er nødvendigt at forberede isposen på forhånd og undgå at tage isposen ud direkte fra -80 ℃ og -20 ℃, ellers fryser vævsblokken på grund af lav temperatur, hvilket resulterer i vævsskade.

   ③ Fordøjelse: Frisk hjertevæv (ikke mindre end 100 mg kontrolvæv, 3-4 stykker stikvæv (16G punkturnål, 1,5 cm)), skåret i 1~3 mm3 vævsblokke og overført til 15 ml EP-rør med DMEM indeholdende collagenase I (450 U ML-1), DNase I (60 U ML-1) og hyaluronidase (60 U ML-1). Inkuber ved 37 ° C i 1 time, tilsæt derefter HBB-buffer (2 % FBS og 0,2 % BSA i HBSS) for at stoppe fordøjelsen, filtrer gennem et 40 µm filter ind i et 50 ml konisk rør, overfør til et rent 15 ml EP-rør og centrifuger ved 4°C 350g i 5 min. Supernatanten blev derefter fjernet, og partiklerne blev resuspenderet i 1 ml ACK-lysebuffer (Gibco, A10492), fordøjet ved stuetemperatur i 5 minutter, før 9 ml DMEM blev tilsat. Supernatanten blev fjernet ved centrifugering og resuspenderet i 5 ml FACS-buffer (2 % FBS og 2 mM EDTA, i en calcium/magnesium-fri PBS).

   ④ Sortering: Centrifugering blev gentaget under ovenstående betingelser, supernatanten blev fjernet, og cellepartiklerne blev resuspenderet i 300 µl cellesuspensionsbuffer (0,04% BSA, 1×PBS) og 1 µl DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) og 4,6-diaminidin - 2-phenylindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) og inkuberes i 5 minutter før sortering. DRAQ5+/DAPI-celler opsamles i en celleresuspensionsbuffer. De opsamlede celler blev derefter re-centrifugeret i overensstemmelse med ovenstående parametre og resuspenderet i en celle-resuspensionsbuffer til en målkoncentration på 1.000 celler ul-1. Cellerne tælles med en blodcelletæller og koncentrationen justeres efter behov.

   ⑤ Databaseopbygning: Alle reagenser, der kræves til databaseopbygning, er inkluderet i 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 kit eller BD database building kit.