Sequenziamento di singole cellule e studi omici multidimensionali nelle malattie cardiovascolari e neurologiche

Raccolta dati clinici Dati clinici (nome, età, sesso, rapporto peso/altezza (BMI), tre procedure di routine (routine del sangue, routine delle feci, routine delle urine), biochimica del sangue, funzionalità epatica e renale, funzione di coagulazione, elettrocardiogramma al letto del paziente, 24- elettrocardiogramma holter di un'ora, ecografia color Doppler cardiaco, ecografia color Doppler carotideo, storia familiare, storia passata, storia di farmaci, storia di trattamento e storia personale) sono stati raccolti da pazienti che soddisfacevano i criteri di inclusione e i controlli ecc.), firmano un consenso informato scritto .

1. Raccolta del sangue: raccogliere 5-10 ml di sangue a digiuno dalla popolazione sperimentale al mattino per la routine del sangue, la biochimica del sangue, la funzionalità epatica e renale, la funzionalità della coagulazione e altri test.
2. Raccolta fecale: verranno raccolti 3-5 g di feci della popolazione sperimentale senza mangiare dalle 6:00 alle 9:00 per la routine delle feci e il rilevamento della flora intestinale. Nota: il campione non deve assumere antibiotici e altri farmaci entro 45 giorni.

3. Raccolta delle urine: raccogliere la prima urina del gruppo sperimentale al mattino e riservare 10-12 ml di urina fresca del flusso intermedio per il rilevamento di routine delle urine.

   Dopo aver testato i campioni raccolti sopra, i risultati del test sono stati inseriti nei corrispondenti dati della popolazione sperimentale.

Sequenziamento di singole cellule

1. Raccolta ed elaborazione dei campioni ① Raccolta dei campioni:

   Raccolta campioni di pazienti con fibrillazione atriale:

   Una piccola quantità di tessuto inutile dell'appendice atriale sinistra (100 mg) è stata prelevata come campione durante il trattamento chirurgico di pazienti con fibrillazione atriale. (Il tessuto utilizzato in questo studio era tessuto residuo o tessuto abbandonato ed entrambi erano necessari per la resezione chirurgica, quindi non vi era alcun rischio aggiuntivo per i soggetti)

   Raccolta di campioni di tessuto cardiaco per il controllo della fibrillazione atriale:

   Il tessuto cardiaco di controllo della fibrillazione atriale era costituito da 100 mg di tessuto di scarto tagliato dal cuore di un donatore di trapianto di cuore.

   Raccolta di campioni di aterosclerosi carotidea:

   Durante il trattamento chirurgico dell'endoarterectomia della placca aterosclerotica carotidea, è stato raccolto come campione almeno 1 mg di tessuto centrale della placca vascolare scartata.

   Raccolta dei campioni di controllo dell'aterosclerosi carotidea:

   Durante il trattamento chirurgico dell'endoarterectomia della placca aterosclerotica carotidea, è stato raccolto come campione di controllo almeno 1 mg di tessuto marginale della placca vascolare scartata.

   Raccolta dei campioni della malattia di Moyamoya:

   Durante l'intervento di bypass cerebrovascolare per la malattia di Moyamoya, è stato raccolto come campione almeno 1 mg di tessuto vascolare scartato.

   Raccolta dei campioni per il controllo della malattia di Moyamoya:

   Durante l'intervento chirurgico di bypass cerebrovascolare in pazienti non affetti da malattia di moyamoya, è stato raccolto come campione almeno 1 mg di tessuto vascolare di scarto tagliato.

   • Conservazione e consegna dei campioni: considerare che gli esperimenti in loco devono essere prenotati in anticipo e coordinati e che vi sono molti fattori incerti nella raccolta dei campioni clinici. Per la maggior parte dei campioni appena ottenuti, si consiglia Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Ottimizzata per la conservazione di campioni di organi e tessuti freschi, la soluzione di conservazione è stata testata e convalidata su una varietà di tessuti umani e di topo, inclusi tumori, pelle, cuore, milza, cervello e muscolo scheletrico.

   Procedura per l'utilizzo della soluzione di conservazione: a) Raccogliere campioni freschi dalla sala operatoria o dall'anatomia e rimuovere rapidamente i tessuti non bersaglio come grasso, capelli, fibre, parti necrotiche, ecc., entro 10 minuti; b) Se il blocco di tessuto è grande, si consiglia di dividerlo in dimensioni di semi di soia e salvarlo o conservarlo come backup; c) Trasferire direttamente il campione nella soluzione di conservazione dei tessuti preraffreddata (2-8 ℃) (provetta EP da 1,5 ml) per garantire che i blocchi di tessuto siano completamente coperti e che il nome del campione sia ben contrassegnato; d) Sigillare la provetta del campione con pellicola sigillante, separare il campione dall'impacco di ghiaccio con carta schiumata, metterlo in un sacchetto con chiusura a zip e predisporre l'impacco di ghiaccio da inviare il prima possibile. a) La soluzione per la conservazione dei tessuti può essere conservata per 48 ore. Per garantire la qualità del campione, la consegna logistica dovrebbe essere consegnata il giorno successivo o la mattina successiva e la spedizione dovrebbe essere consegnata prima della data del campione. b) Si consiglia di posizionare abbastanza impacchi di ghiaccio per evitare la completa fusione ed evitare il contatto diretto con la provetta del campione, causando il congelamento del campione; c) Selezionare una scatola di schiuma con uno spessore non inferiore a 3 cm e inserire prima degli impacchi di ghiaccio sul fondo; d) La provetta del campione e l'impacco di ghiaccio devono essere separati da carta schiuma o sacchetto a bolle; È necessario preparare l'impacco di ghiaccio in anticipo ed evitare di toglierlo direttamente da -80 ℃ e -20 ℃, altrimenti il ​​blocco di tessuto si congelerà a causa della bassa temperatura, con conseguenti danni ai tessuti.

   ③ Digestione: tessuto cardiaco fresco (non meno di 100 mg di tessuto di controllo ritagliato, 3-4 pezzi di tessuto da puntura (ago da puntura da 16G, 1,5 cm)), tagliato in blocchi di tessuto da 1~3 mm3 e trasferito in provette EP da 15 ml di DMEM contenente collagenasi I (450 U ML-1), DNasi I (60 U ML-1) e ialuronidasi (60 U ML-1). Incubare a 37°C per 1 ora, quindi aggiungere tampone HBB (2% FBS e 0,2% BSA in HBSS) per arrestare la digestione, filtrare attraverso un filtro da 40 µm in una provetta conica da 50 ml, trasferire in una provetta EP pulita da 15 ml e centrifugare a 4°C 350g per 5 min. Il surnatante è stato quindi rimosso e le particelle sono state risospese in 1 ml di tampone di lisi ACK (Gibco, A10492), digerite a temperatura ambiente per 5 minuti prima di aggiungere 9 ml di DMEM. Il surnatante è stato rimosso mediante centrifugazione e risospeso in 5 ml di tampone FACS (2% FBS e 2 mM EDTA, in PBS privo di calcio/magnesio).

   ④ Ordinamento: la centrifugazione è stata ripetuta nelle condizioni sopra indicate, il surnatante è stato rimosso e le particelle cellulari sono state risospese in 300 µl di tampone di sospensione cellulare (0,04% BSA, 1×PBS) e 1 µl di DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) e 4,6-diaminidina - 2-fenilindolo (DAPI; BD Biosciences, 564907) e incubare per 5 minuti prima dello smistamento. Le cellule DRAQ5+/DAPI- vengono raccolte in un tampone di risospensione cellulare. Le cellule raccolte sono state quindi ricentrifugate secondo i parametri di cui sopra e risospese in un tampone di risospensione cellulare ad una concentrazione target di 1.000 cellule ul-1. Le cellule vengono contate con un contatore di cellule del sangue e la concentrazione viene regolata secondo necessità.

   ⑤ Creazione di database: tutti i reagenti necessari per la creazione di database sono inclusi nel kit di reagenti v2 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 o nel kit di creazione di database BD.