심혈관 및 신경 질환에 대한 단일 세포 시퀀싱 및 다차원 오믹스 연구

임상 데이터 수집 임상 데이터(이름, 나이, 성별, 체중/신장 비율(BMI), 3가지 루틴 절차(혈액 루틴, 대변 루틴, 소변 루틴), 혈액 생화학, 간 및 신장 기능, 응고 기능, 병상 심전도, 24- 아워홀터 심전도, 심장색도플러초음파, 경동맥색도플러초음파, 가족력, 과거력, 약물치료력, 치료기록, 개인병력)을 포함기준에 부합하는 환자로부터 수집 및 대조 등), 서면 동의서에 서명 .

1. 혈액 채취: 혈액 루틴, 혈액 생화학, 간 및 신장 기능, 응고 기능 및 기타 검사를 위해 아침에 실험 집단으로부터 공복 혈액 5-10ml를 수집합니다.
2. 대변 ​​수집: 오전 6시부터 오전 9시까지 식사를 하지 않은 실험 집단의 대변 3-5g을 대변 루틴 및 장내 세균총 검출을 위해 수집합니다. 참고: 검체는 45일 이내에 항생제 및 기타 약물을 복용해서는 안 됩니다.

3. 소변 채취 : 실험군의 아침 첫 소변을 채취하고, 일상적인 소변 검출을 위해 신선한 중류 소변 ​​10~12ml를 비축해 둡니다.

   위에서 수집한 샘플을 테스트한 후 테스트 결과를 해당 실험 모집단 데이터에 입력했습니다.

단일 세포 시퀀싱

1. 검체 채취 및 처리 ① 검체 채취:

   심방세동 환자의 샘플 수집:

   심방세동 환자의 수술적 치료 시 소량의 쓸모없는 좌심방이 조직 100mg을 검체로 채취하였습니다. (본 연구에 사용된 조직은 잔여조직 또는 유기조직 중 하나였으며, 둘 다 수술적 절제를 위해 필요한 조직이므로 피험자에게 추가적인 위험은 없었다)

   심방세동 조절 심장 조직 샘플 수집:

   심방세동 조절 심장 조직은 심장 이식 기증자 심장에서 잘라낸 폐기물 조직 100mg입니다.

   경동맥 죽상동맥경화증 샘플 수집:

   경동맥 죽상동맥경화반 동맥내막절제술의 수술적 치료 중, 폐기된 혈관반의 중심 조직 중 최소 1mg을 검체로 채취했습니다.

   경동맥 죽상동맥경화증 대조 샘플 수집:

   경동맥 죽상동맥경화반 동맥내막절제술의 수술적 치료 동안, 폐기된 혈관판의 최소 1mg의 변연 조직을 대조군 샘플로 수집했습니다.

   모야모야병 샘플 수집:

   모야모야병에 대한 뇌혈관우회수술 시 최소 1mg의 폐기된 혈관조직을 검체로 채취하였습니다.

   모야모야 질병 통제 샘플 수집:

   비모야모야병 환자의 뇌혈관우회수술 시 최소 1mg의 전정된 폐혈관조직이 검체로 채취되었습니다.

   • 검체 보존 및 배송: 현장 실험은 사전 예약 및 조율이 필요하고, 임상 검체 채취에는 불확실한 요소가 많다는 점을 고려합니다. 새로 얻은 대부분의 샘플에는 Miltenyi MACS Tissue Storage Solution®(130-100-008)을 권장합니다. 신선한 장기 및 조직 샘플의 보관에 최적화된 보존 솔루션은 종양, 피부, 심장, 비장, 뇌 및 골격근을 포함한 다양한 인간 및 마우스 조직에서 테스트되고 검증되었습니다.

   보존액 사용 절차: a) 수술실이나 해부체에서 신선한 검체를 채취하고, 지방, 머리카락, 섬유질, 괴사 부위 등 비표적 조직을 10분 이내에 신속하게 제거합니다. b) 조직 블록이 큰 경우에는 대두 크기로 나누어 저장하거나 백업용으로 보관하는 것이 좋습니다. c) 샘플을 미리 냉각된(2~8℃) 조직 보존 용액(1.5ml EP 튜브)에 직접 옮겨 조직 블록이 완전히 덮이고 샘플 이름이 잘 표시되는지 확인합니다. d) 검체 튜브를 밀봉필름으로 밀봉하고, 아이스팩과 검체를 발포종이로 분리한 후 지퍼백에 담아 아이스팩을 최대한 빨리 발송하도록 조치합니다. a) 조직 보관 용액은 48시간 동안 보관할 수 있습니다. 샘플의 품질 확보를 위해 물류 배송은 익일 또는 익일 오전에 배송되어야 하며, 우편물은 샘플 날짜 이전에 배송되어야 합니다. b) 완전히 녹는 것을 방지하고, 시료 튜브와 직접 접촉하여 시료가 얼지 않도록 충분한 얼음 팩을 두는 것이 좋습니다. c) 두께가 3cm 이상인 폼 상자를 선택하고 바닥에 얼음 팩을 먼저 넣습니다. d) 샘플 튜브와 얼음주머니는 발포종이나 버블백으로 분리되어야 합니다. 얼음주머니를 미리 준비해야 하며, -80℃, -20℃에서 직접 얼음주머니를 꺼내지 마십시오. 그렇지 않으면 낮은 온도로 인해 조직 블록이 얼어 조직이 손상될 수 있습니다.

   ③ 소화 : 신선한 심장 조직(대조군 클립 조직 100mg 이상, 천자 조직 3~4개(16G 천자 바늘, 1.5cm))를 1~3mm3 조직 블록으로 잘게 썰어 DMEM의 15ml EP 튜브에 옮김 콜라게나제 I(450 U ML-1), DNase I(60 U ML-1) 및 히알루로니다제(60 U ML-1)가 함유되어 있습니다. 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음 HBB 완충액(HBSS 내 2% FBS 및 0.2% BSA)을 첨가하여 소화를 중지하고 40μm 필터를 통해 50ml 원뿔형 튜브로 여과한 다음 깨끗한 15ml EP 튜브로 옮기고 4°C 350g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 입자를 1ml의 ACK 용해 완충액(Gibco, A10492)에 재현탁하고 실온에서 5분 동안 분해한 후 9ml의 DMEM을 첨가했습니다. 상청액을 원심분리에 의해 제거하고 5 ml FACS 완충액(칼슘/마그네슘이 없는 PBS 중 2% FBS 및 2mM EDTA)에 재현탁시켰습니다.

   ④ 분류: 상기 조건에서 원심분리를 반복하여 상등액을 제거하고 세포입자를 300μl 세포 현탁 완충액(0.04%BSA, 1XPBS)과 1μl DRAQ5(Thermo Fisher Scientific, 62251)에 재현탁시켰다. 및 4, 6-디아미니딘 - 2-페닐인돌(DAPI; BD Biosciences, 564907)을 첨가하고 분류하기 전에 5분 동안 배양합니다. DRAQ5+/DAPI- 세포는 세포 재현탁 완충액에 수집됩니다. 그런 다음 수집된 세포를 위의 매개변수에 따라 다시 원심분리하고 세포 재현탁 완충액에 1,000개 세포 ul-1의 목표 농도로 재현탁했습니다. 세포는 혈구 계수기로 계수하고 농도는 필요에 따라 조정됩니다.

   ⑤ 데이터베이스 구축: 데이터베이스 구축에 필요한 모든 시약은 10X Genomics Single Cell 3' Reagent Kits v2 키트 또는 BD 데이터베이스 구축 키트에 포함되어 있습니다.