Séquençage unicellulaire et études omiques multidimensionnelles dans les maladies cardiovasculaires et neurologiques

Collecte de données cliniques Données cliniques (nom, âge, sexe, rapport poids/taille (IMC), trois procédures de routine (routine sanguine, routine selles, routine urinaire), biochimie sanguine, fonctions hépatique et rénale, fonction de coagulation, électrocardiogramme au chevet, 24- électrocardiogramme holter horaire, échographie Doppler couleur du cœur, échographie Doppler couleur carotidienne, antécédents familiaux, antécédents médicaux, antécédents de traitement et antécédents personnels) ont été recueillis auprès de patients répondant aux critères d'inclusion et aux contrôles, etc.), signez un consentement éclairé écrit .

1. Collecte de sang : prélevez 5 à 10 ml de sang à jeun auprès de la population expérimentale le matin pour la routine sanguine, la biochimie sanguine, la fonction hépatique et rénale, la fonction de coagulation et d'autres tests.
2. Collecte fécale : 3 à 5 g de matières fécales de la population expérimentale sans manger de 6h00 à 9h00 seront collectées pour la routine des selles et la détection de la flore intestinale. Remarque : L'échantillon ne doit pas prendre d'antibiotiques ni d'autres médicaments dans les 45 jours.

3. Collecte d'urine : recueillez la première urine du groupe expérimental le matin et réservez 10 à 12 ml d'urine fraîche du milieu du jet pour la détection urinaire de routine.

   Après avoir testé les échantillons collectés ci-dessus, les résultats des tests ont été intégrés aux données de population expérimentale correspondantes.

Séquençage de cellules uniques

1. Prélèvement et traitement des échantillons ① Prélèvement des échantillons :

   Prélèvement d'échantillons de patients atteints de fibrillation auriculaire :

   Une petite quantité de tissu inutile de l'appendice auriculaire gauche (100 mg) a été prélevée comme échantillon lors du traitement chirurgical de patients atteints de fibrillation auriculaire. (Le tissu utilisé dans cette étude était soit du tissu résiduel, soit du tissu abandonné, et les deux étaient nécessaires à la résection chirurgicale, il n'y avait donc aucun risque supplémentaire pour les sujets)

   Prélèvement d’échantillons de tissus cardiaques pour le contrôle de la fibrillation auriculaire :

   Le tissu cardiaque de contrôle de la fibrillation auriculaire était composé de 100 mg de déchets coupés provenant du cœur d'un donneur de transplantation cardiaque.

   Prélèvement d’échantillons d’athérosclérose carotidienne :

   Au cours du traitement chirurgical de l'endartériectomie de la plaque athéroscléreuse carotidienne, au moins 1 mg du tissu central de la plaque vasculaire rejetée a été collecté comme échantillon.

   Collecte d’échantillons de contrôle de l’athérosclérose carotidienne :

   Au cours du traitement chirurgical de l'endartériectomie de la plaque athéroscléreuse carotidienne, au moins 1 mg de tissu marginal de la plaque vasculaire rejetée a été collecté comme échantillons de contrôle.

   Collecte d’échantillons pour la maladie de Moyamoya :

   Au cours d’un pontage cérébrovasculaire pour la maladie de Moyamoya, au moins 1 mg de tissu vasculaire rejeté a été collecté comme échantillon.

   Collecte d'échantillons pour le contrôle de la maladie de Moyamoya :

   Au cours d'un pontage cérébrovasculaire chez des patients non atteints de la maladie de Moyamoya, au moins 1 mg de tissu vasculaire élagué a été collecté comme échantillon.

   • Conservation et livraison des échantillons : étant donné que les expériences sur site doivent être réservées à l'avance et coordonnées, et qu'il existe de nombreux facteurs incertains dans la collecte d'échantillons cliniques. Pour la plupart des échantillons fraîchement obtenus, Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008) est recommandé. Optimisée pour le stockage d'échantillons d'organes et de tissus frais, la solution de conservation a été testée et validée sur une variété de tissus humains et de souris, notamment des tumeurs, de la peau, du cœur, de la rate, du cerveau et des muscles squelettiques.

   Procédure d'utilisation de la solution de conservation : a) Prélever des échantillons frais de la salle d'opération ou de l'anatomie et éliminer rapidement les tissus non ciblés tels que la graisse, les cheveux, les fibres, les parties nécrotiques, etc., dans un délai de 10 minutes ; b) Si le bloc de tissu est volumineux, il est recommandé de le diviser en graines de soja et de le conserver ou de le conserver pour sauvegarde ; c) Transférez directement l'échantillon dans la solution de préservation des tissus pré-refroidie (2-8 ℃) (tube EP de 1,5 ml) pour vous assurer que les blocs de tissus sont complètement recouverts et que le nom de l'échantillon est bien marqué ; d) Scellez le tube d'échantillon avec un film d'étanchéité, séparez l'échantillon du sac de glace avec du papier mousse, placez-le dans un sac ziplock et faites en sorte que le sac de glace soit envoyé dès que possible. a) La solution de conservation des tissus peut être conservée pendant 48 heures. Afin de garantir la qualité de l'échantillon, la livraison logistique doit être livrée le lendemain ou le lendemain matin, et l'envoi doit être livré avant la date de l'échantillon. b) Il est recommandé de placer suffisamment de blocs de glace pour éviter une fonte complète et pour éviter tout contact direct avec le tube d'échantillon, provoquant le gel de l'échantillon ; c) Sélectionnez une boîte en mousse d'une épaisseur d'au moins 3 cm et placez d'abord des blocs de glace dans le fond ; d) Le tube d'échantillon et le sac de glace doivent être séparés par du papier mousse ou un sac à bulles ; Il est nécessaire de préparer le sac de glace à l'avance et d'éviter de sortir le sac de glace directement de -80 ℃ et -20 ℃, sinon le bloc de tissu gèlera en raison de la basse température, entraînant des dommages aux tissus.

   ③ Digestion : tissu cardiaque frais (pas moins de 100 mg de tissu coupé de contrôle, 3-4 morceaux de tissu de ponction (aiguille de ponction 16G, 1,5 cm)), coupé en blocs de tissu de 1 à 3 mm3, et transféré dans des tubes EP de 15 ml de DMEM contenant de la collagénase I (450 U ML-1), de la DNase I (60 U ML-1) et de la hyaluronidase (60 U ML-1). Incuber à 37°C pendant 1 heure, puis ajouter du tampon HBB (2% FBS et 0,2% BSA dans HBSS) pour arrêter la digestion, filtrer sur filtre 40 µm dans un tube conique de 50 ml, transférer dans un tube EP propre de 15 ml et centrifuger à 4°C 350g pendant 5 min. Le surnageant a ensuite été éliminé et les particules ont été remises en suspension dans 1 ml de tampon de lyse ACK (Gibco, A10492), digérées à température ambiante pendant 5 minutes avant d'ajouter 9 ml de DMEM. Le surnageant a été éliminé par centrifugation et remis en suspension dans 5 ml de tampon FACS (2 % de FBS et 2 mM d'EDTA, dans un PBS sans calcium/magnésium).

   ④ Tri : La centrifugation a été répétée dans les conditions ci-dessus, le surnageant a été éliminé et les particules cellulaires ont été remises en suspension dans 300 µl de tampon de suspension cellulaire (0,04 % de BSA, 1 × PBS) et 1 µl de DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251). et 4,6-diaminidine - 2-phénylindole (DAPI ; BD Biosciences, 564907) et incuber pendant 5 minutes avant de trier. Les cellules DRAQ5+/DAPI- sont collectées dans un tampon de remise en suspension cellulaire. Les cellules collectées ont ensuite été recentrifugées selon les paramètres ci-dessus et remises en suspension dans un tampon de remise en suspension cellulaire jusqu'à une concentration cible de 1 000 cellules ul-1. Les cellules sont comptées avec un compteur de cellules sanguines et la concentration est ajustée selon les besoins.

   ⑤ Création de base de données : tous les réactifs requis pour la création de base de données sont inclus dans le kit 10X Genomics Single Cell 3 'Reagent Kits v2 ou le kit de création de base de données BD.