Yksisolusekvensointi ja moniulotteiset omiikkatutkimukset sydän- ja verisuonisairauksissa ja neurologisissa sairauksissa

Kliinisen tiedon keruu Kliiniset tiedot (nimi, ikä, sukupuoli, paino/pituussuhde (BMI), kolme rutiinitoimenpidettä (verirutiini, ulosteen rutiini, virtsan rutiini), veren biokemia, maksan ja munuaisten toiminta, hyytymistoiminto, sängyn elektrokardiogrammi, 24-vuotiaat tunnin holter-sähkökardiogrammi, sydämen värin Doppler-ultraääni, kaulavaltimon väri-Doppler-ultraääni, sukuhistoria, aiempi historia, lääkityshistoria, hoitohistoria ja henkilöhistoria) kerättiin potilailta, jotka täyttivät sisällyttämiskriteerit ja kontrollit jne.), allekirjoittaa kirjallinen tietoinen suostumus .

1. Verenotto: Kerää 5-10 ml paastoverta koepopulaatiosta aamulla verirutiinia, veren biokemiaa, maksan ja munuaisten toimintaa, hyytymistoimintoa ja muita kokeita varten.
2. Ulosteenkeräys: 3–5 g ulosteita koepopulaatiosta syömättä klo 6.00–9.00 kerätään ulosterutiinia ja suolistoflooran havaitsemista varten. Huomautus: Näyte ei saa ottaa antibiootteja tai muita lääkkeitä 45 päivän kuluessa.

3. Virtsan kerääminen: Kerää koeryhmän ensimmäinen virtsa aamulla ja varaa 10-12 ml tuoretta virtsaa rutiininomaiseen virtsan havaitsemiseen.

   Edellä kerättyjen näytteiden testauksen jälkeen testitulokset liitettiin vastaaviin kokeellisiin populaatiotietoihin.

Yhden solun sekvensointi

1. Näytteenotto ja käsittely ① Näytteenotto:

   Näytteenotto eteisvärinäpotilaista:

   Eteisvärinäpotilaiden kirurgisen hoidon aikana otettiin näytteeksi pieni määrä 100 mg hyödytöntä vasemman eteisen lisäkudosta. (Tässä tutkimuksessa käytetty kudos oli joko jäännöskudosta tai hylättyä kudosta, ja molemmat olivat välttämättömiä kirurgiseen resektioon, joten koehenkilöille ei aiheutunut lisäriskiä)

   Eteisvärinän säätelyn sydänkudosnäytteiden kerääminen:

   Eteisvärinän kontrollisydänkudos oli 100 mg leikattua jätekudosta sydämensiirron luovuttajan sydämestä.

   Kaulavaltimon ateroskleroosinäytekokoelma:

   Kaulavaltimon ateroskleroottisen plakin endarterektomian kirurgisen hoidon aikana kerättiin näytteeksi vähintään 1 mg poistetun verisuoniplakin keskuskudosta.

   Kaulavaltimon ateroskleroosin kontrollinäyte:

   Kaulavaltimon ateroskleroottisen plakin endarterektomian kirurgisen hoidon aikana kerättiin kontrollinäytteiksi vähintään 1 mg marginaalikudosta hylätystä vaskulaarisesta plakista.

   Moyamoya-taudin näytekokoelma:

   Moyamoyan taudin aivoverenkierron ohitusleikkauksen aikana kerättiin näytteeksi vähintään 1 mg hylättyä verisuonikudosta.

   Moyamoya-taudin torjuntanäytekokoelma:

   Muiden kuin moyamoya-potilaiden aivoverenkierron ohitusleikkauksen aikana kerättiin näytteeksi vähintään 1 mg leikattua jäteverisuonikudosta.

   • Näytteiden säilytys ja toimitus: Ottaen huomioon, että paikan päällä tehtävät kokeet on varattava etukäteen ja koordinoitava, ja kliinisen näytteen keruussa on monia epävarmoja tekijöitä. Useimmille tuoreille näytteille suositellaan Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008) -liuosta. Tuoreiden elin- ja kudosnäytteiden varastointiin optimoitu säilöntäliuos on testattu ja validoitu useissa ihmisen ja hiiren kudoksissa, mukaan lukien kasvaimet, iho, sydän, perna, aivot ja luurankolihakset.

   Säilöntäliuoksen käyttömenettely: a) Kerää tuoreita näytteitä leikkaussalista tai anatomiasta ja poista nopeasti ei-kohdekudokset, kuten rasva, hiukset, kuidut, nekroottiset osat jne. 10 minuutin kuluessa; b) Jos kudoslohko on suuri, on suositeltavaa jakaa se soijapapukokoon ja tallentaa tai säilyttää varmuuskopiointia varten; c) Siirrä näyte suoraan esijäähdytettyyn (2-8 ℃) kudossäilöntäliuokseen (1,5 ml EP-putki) varmistaaksesi, että kudoslohkot ovat täysin peitettyinä ja näytteen nimi on merkitty hyvin; d) Sulje näyteputki tiivistekalvolla, irrota näyte jääpakkauksesta vaahtopaperilla, laita se vetoketjulliseen pussiin ja järjestä jääpakkaus lähetettäväksi mahdollisimman pian. a) Kudossäilytysliuosta voidaan säilyttää 48 tuntia. Näytteen laadun varmistamiseksi logistiikkatoimitus tulee toimittaa seuraavana päivänä tai seuraavana aamuna ja postitus ennen näytepäivää. b) On suositeltavaa sijoittaa tarpeeksi jääpakkauksia täydellisen sulamisen välttämiseksi ja suoran kosketuksen välttämiseksi näyteputken kanssa, mikä saa näytteen jäätymään. c) Valitse vaahtomuovilaatikko, jonka paksuus on vähintään 3 cm, ja laita ensin jääpakkauksia pohjalle; d) Näyteputki ja jääpakkaus on erotettava vaahtopaperilla tai kuplapussilla; Jääpussi on valmisteltava etukäteen ja vältettävä jääpussin ottamista suoraan ulos -80 ℃ ja -20 ℃ lämpötilasta, muuten kudoslohko jäätyy alhaisen lämpötilan vuoksi, mikä johtaa kudosvaurioihin.

   ③ Ruoansulatus: Tuore sydänkudos (vähintään 100 mg leikattua kontrollikudosta, 3-4 kappaletta pistokudosta (16 G pistoneula, 1,5 cm)), pilkottuna 1–3 mm3:n kudoslohkoiksi ja siirretty 15 ml:n DMEM-EP-putkiin joka sisältää kollagenaasi I:tä (450 U ML-1), DNaasi I:tä (60 U ML-1) ja hyaluronidaasia (60 U ML-1). Inkuboi 37 °C:ssa 1 tunti, lisää sitten HBB-puskuria (2 % FBS ja 0,2 % BSA HBSS:ssä) pilkkomisen lopettamiseksi, suodata 40 µm:n suodattimen läpi 50 ml:n kartiomaiseen putkeen, siirrä puhtaaseen 15 ml:n EP-putkeen ja sentrifugoi 4 °C:ssa 350 g 5 minuuttia. Sitten supernatantti poistettiin ja partikkelit suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan ACK-lyysipuskuria (Gibco, A10492), digestoitiin huoneenlämpötilassa 5 minuuttia ennen kuin lisättiin 9 ml DMEM:ää. Supernatantti poistettiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan FACS-puskuria (2 % FBS ja 2 mM EDTA, kalsium/magnesiumivapaassa PBS:ssä).

   ④ Lajittelu: Sentrifugointi toistettiin yllä olevissa olosuhteissa, supernatantti poistettiin ja solupartikkelit suspendoitiin uudelleen 300 µl:aan solususpensiopuskuria (0,04 % BSA, 1 × PBS) ja 1 µl:aan DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251) ja 4,6-diaminidiini-2-fenyyli-indoli (DAPI; BD Biosciences, 564907) ja inkuboi 5 minuuttia ennen lajittelua. DRAQ5+/DAPI- solut kerätään solujen uudelleensuspendointipuskuriin. Kerätyt solut sentrifugoitiin sitten uudelleen yllä olevien parametrien mukaisesti ja suspensoitiin uudelleen solujen uudelleensuspendointipuskuriin tavoitepitoisuuteen 1 000 solua ul-1. Solut lasketaan verisolulaskurilla ja pitoisuutta säädetään tarpeen mukaan.

   ⑤ Tietokannan rakentaminen: Kaikki tietokannan rakentamiseen tarvittavat reagenssit sisältyvät 10X Genomics Single Cell 3 Reagent Kits v2 -pakkaukseen tai BD-tietokannan rakennuspakkaukseen.