Secuenciación unicelular y estudios ómicos multidimensionales en enfermedades cardiovasculares y neurológicas

Recopilación de datos clínicos Datos clínicos (nombre, edad, sexo, relación peso/altura (IMC), tres procedimientos de rutina (rutina de sangre, rutina de heces, rutina de orina), bioquímica sanguínea, función hepática y renal, función de coagulación, electrocardiograma de cabecera, 24- electrocardiograma holter horario, ecografía Doppler color del corazón, ecografía Doppler color de la carótida, antecedentes familiares, antecedentes, antecedentes de medicación, antecedentes de tratamiento e antecedentes personales) de los pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión y controles, etc.), firmaron un consentimiento informado por escrito. .

1. Extracción de sangre: recolecte de 5 a 10 ml de sangre en ayunas de la población experimental por la mañana para realizar pruebas de rutina sanguínea, bioquímica sanguínea, función hepática y renal, función de coagulación y otras pruebas.
2. Recolección de heces: se recolectarán de 3 a 5 g de heces de la población experimental sin comer de 6 am a 9 am para la rutina de heces y la detección de la flora intestinal. Nota: La muestra no debe tomar antibióticos ni otros medicamentos dentro de los 45 días.

3. Recolección de orina: recolecte la primera orina del grupo experimental por la mañana y reserve de 10 a 12 ml de orina fresca a mitad del chorro para la detección de orina de rutina.

   Después de probar las muestras recolectadas anteriormente, los resultados de las pruebas se incorporaron a los datos de la población experimental correspondiente.

Secuenciación unicelular

1. Recolección y procesamiento de muestras ① Recolección de muestras:

   Recogida de muestras de pacientes con fibrilación auricular:

   Se tomó como muestra una pequeña cantidad de tejido inútil de la orejuela auricular izquierda (100 mg) durante el tratamiento quirúrgico de pacientes con fibrilación auricular. (El tejido utilizado en este estudio fue tejido residual o tejido abandonado, y ambos fueron necesarios para la resección quirúrgica, por lo que no hubo riesgo adicional para los sujetos)

   Recolección de muestras de tejido cardíaco para el control de la fibrilación auricular:

   El tejido cardíaco para el control de la fibrilación auricular consistió en 100 mg de tejido de desecho cortado del corazón de un donante para trasplante de corazón.

   Recolección de muestras de aterosclerosis carotídea:

   Durante el tratamiento quirúrgico de la endarterectomía de placa aterosclerótica carotídea, se recogió como muestra al menos 1 mg del tejido central de la placa vascular desechada.

   Recogida de muestras de control de aterosclerosis carotídea:

   Durante el tratamiento quirúrgico de la endarterectomía de placa aterosclerótica carotídea, se recogió al menos 1 mg de tejido marginal de placa vascular descartada como muestra de control.

   Recogida de muestras de la enfermedad de Moyamoya:

   Durante la cirugía de bypass cerebrovascular para la enfermedad de Moyamoya, se recogió como muestra al menos 1 mg de tejido vascular desechado.

   Recolección de muestras de control de la enfermedad de Moyamoya:

   Durante la cirugía de derivación cerebrovascular en pacientes sin enfermedad de moyamoya, se recogió como muestra al menos 1 mg de tejido vascular residual podado.

   • Conservación y entrega de muestras: considerando que los experimentos in situ deben reservarse y coordinarse con anticipación, y que existen muchos factores inciertos en la recolección de muestras clínicas. Para la mayoría de las muestras recién obtenidas, se recomienda Miltenyi MACS Tissue Storage Solution® (130-100-008). Optimizada para el almacenamiento de muestras frescas de órganos y tejidos, la solución de conservación ha sido probada y validada en una variedad de tejidos humanos y de ratón, incluidos tumores, piel, corazón, bazo, cerebro y músculo esquelético.

   Procedimiento para utilizar la solución de conservación: a) Recoger muestras frescas del quirófano o anatomía y eliminar rápidamente los tejidos no objetivo como grasa, cabello, fibras, partes necróticas, etc., en 10 minutos; b) Si el bloque de tejido es grande, se recomienda dividirlo en tamaños de soja y guardarlo o conservarlo como respaldo; c) Transfiera directamente la muestra a la solución de conservación de tejido preenfriada (2-8 ℃) (tubo EP de 1,5 ml) para garantizar que los bloques de tejido estén completamente cubiertos y el nombre de la muestra esté bien marcado; d) Selle el tubo de muestra con una película selladora, separe la muestra de la bolsa de hielo con papel de espuma, colóquela en una bolsa ziplock y prepare la bolsa de hielo para enviarla lo antes posible. a) La solución de almacenamiento de tejido se puede almacenar durante 48 h. Para garantizar la calidad de la muestra, la entrega logística debe entregarse al día siguiente o a la mañana siguiente, y el envío por correo debe entregarse antes de la fecha de la muestra. b) Se recomienda colocar suficientes bolsas de hielo para evitar el derretimiento completo, y evitar el contacto directo con el tubo de muestra, provocando que la muestra se congele; c) Seleccione una caja de espuma con un grosor no inferior a 3 cm y coloque primero algunas bolsas de hielo en el fondo; d) El tubo de muestra y la bolsa de hielo deben estar separados por papel de espuma o bolsa de burbujas; Es necesario preparar la bolsa de hielo con anticipación y evitar sacar la bolsa de hielo directamente entre -80 ℃ y -20 ℃, de lo contrario el bloque de tejido se congelará debido a la baja temperatura, lo que provocará daños en el tejido.

   ③ Digestión: tejido cardíaco fresco (no menos de 100 mg de tejido de control recortado, 3-4 trozos de tejido de punción (aguja de punción 16G, 1,5 cm)), cortado en bloques de tejido de 1~3 mm3 y transferido a tubos EP de 15 ml de DMEM. que contiene colagenasa I (450 U ML-1), DNasa I (60 U ML-1) e hialuronidasa (60 U ML-1). Incubar a 37 °C durante 1 hora, luego agregar tampón HBB (2 % FBS y 0,2 % BSA en HBSS) para detener la digestión, filtrar a través de un filtro de 40 µm en un tubo cónico de 50 ml, transferir a un tubo EP limpio de 15 ml y centrifugar a 4°C 350g durante 5 min. Luego se eliminó el sobrenadante y las partículas se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis ACK (Gibco, A10492), se digirieron a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de agregar 9 ml de DMEM. El sobrenadante se eliminó mediante centrifugación y se resuspendió en 5 ml de tampón FACS (FBS al 2 % y EDTA 2 mM, en PBS libre de calcio/magnesio).

   ④ Clasificación: se repitió la centrifugación en las condiciones anteriores, se eliminó el sobrenadante y las partículas celulares se resuspendieron en 300 µl de tampón de suspensión celular (BSA al 0,04 %, 1 x PBS) y 1 µl de DRAQ5 (Thermo Fisher Scientific, 62251). y 4,6-diaminidina - 2-fenilindol (DAPI; BD Biosciences, 564907) e incubar durante 5 minutos antes de clasificar. Las células DRAQ5+/DAPI- se recogen en un tampón de resuspensión celular. A continuación, las células recogidas se volvieron a centrifugar según los parámetros anteriores y se resuspendieron en un tampón de resuspensión celular hasta una concentración objetivo de 1.000 células ul-1. Las células se cuentan con un contador de células sanguíneas y la concentración se ajusta según sea necesario.

   ⑤ Creación de bases de datos: todos los reactivos necesarios para la creación de bases de datos se incluyen en el kit v2 de kits de reactivos 10X Genomics Single Cell 3 'o en el kit de creación de bases de datos BD.