ジェンダーの観点から見た非外科的歯周治療の免疫系への影響

ベースライン時および非外科的歯周治療の 12 週間後に、血液、歯肉溝液 (GCF)、および唾液のサンプルが患者から収集されます。 絶食血液サンプル (12 時間) から、末梢血単核球 (PBMC) および好中球画分が、製造元のプロトコールに従って免疫磁気法を使用して単離され、血漿および血清は分析まで -80°C で保存されます。 LUNA-FL は、細胞サンプル中の細胞数と生存率 (アクリジン オレンジとヨウ化プロピジウムの二重染色) を測定するために使用されます。 滅菌ペーパーポイントを歯周ポケット 1 mm に 30 秒間注意深く挿入することにより、GCF サンプルを二重に収集します。 体積は Periotron 8000 を使用して測定され、将来の測定のために -80°C で保存されます。 刺激されていない唾液は喀出によってRNaseフリーのチューブに収集され、遠心分離後、上清はマイクロRNA（miRNA）分析のために-80℃で保存されます。

プロービングポケットの深さ（PD）、臨床アタッチメントレベル（CAL）のミリメートル、プロービング時出血（BOP）、シルネスとレーの簡易プラーク指数、およびグリーンとバーミリオンの簡易歯石指数の臨床歯周パラメーターは、従来のマニュアルを使用して決定されます。歯周プローブ（UNC-15 PCP）。 歯周検査は、前述のように、第三大臼歯を除くすべての歯について、1 歯あたり 6 か所で PD、CAL、BOP を測定するために実行されます。 患者は病歴、生活習慣（喫煙、歯磨きの頻度、身体活動）、社会人口学的特徴について面接を受けます。 体重、身長、血圧は標準化された方法で測定されます。 炭水化物代謝の生化学パラメータ - グルコース、インスリン、糖化ヘモグロビン (A1c) -、脂質プロファイル - 総コレステロール、LDL、HDL、トリグリセリド (TG)、アポリポタンパク質 AI および B -、新たな炎症性および心血管リスク マーカー - C 反応性タンパク質 ( CRP)、C3c、およびレチノール結合タンパク質 4 (RBP4) - および全血球計算は、病院の臨床分析サービスで測定されます。

タンパク質発現の違いを検出するために、細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む溶解バッファー (RIPA バッファー) 中で摂氏 4 度 (°C) で 15 分間インキュベートします。 16,000gで15分間遠心分離した後、上清を収集します。 総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイを使用して定量されます。 タンパク質 25 μg のアリコートを 8 ～ 16% 勾配 SDS ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写します。 膜を抗アクチン、JNK、NFkB、MCP1、GPX-1、NLRP3、ASC、プロカスパーゼ 1、カスパーゼ 1、NADPH オキシダーゼ、カタラーゼ、GPX1、SOD1、Beclin、ATG5-ATG12、p62 とインキュベートすることで、標的タンパク質が検出されます。 、LC3 I、LC3 II、Pink1、GRP78、eIF2α、IRE1 α、ATF6、CHOP、PGC1 α、mTFA、VDAC、複合体 I、II、III、IV、および V。 タンパク質シグナルは化学発光によって検出され、濃度測定によって分析されます。

PBMC における NLRP3-ASC の共局在研究によるインフラマソーム複合体の集合 (活性化の第 1 段階) は、共焦点顕微鏡および/または蛍光顕微鏡を使用して実施されます。 簡単に説明すると、PBMC をポリ-D-リジンでコーティングしたカバースリップ上に播種し、4% パラホルムアルデヒド (PFA) で 20 分間固定し、Triton X-100 で 20 分間透過処理し、リン酸緩衝生理食塩水バッファー - ウシ血清アルブミンでブロックします ( PBS-BSA) 3%、室温で 1 時間。 特定の一次抗体 (PBS-BSA 1% で希釈) とのハイブリダイゼーションは 4 °C で一晩実行され、その後、AlexaFluor 蛍光色素分子と結合した二次抗体が暗所で室温で 1 時間インキュベートされます。 染色されたサンプルは、カバーガラスを介して顕微鏡スライド上に転写され、退色防止蛍光封入剤に保存されます。

サイトカイン、接着分子、血清酸化ストレスマーカーの循環レベルは血清サンプルで測定されますが、セクレトーム研究では、1x10^6 PBMC が 10% ウシ胎児血清 (FBS) を含む 1 mL RPMI で 4 時間 (37°C) 培養されます。 C、5% CO2) で上清を取得します。 血清と上清の両方を、Milliplex® MAP Kit メーカーの手順に従って Luminex® 200 分析システムで分析します。 これらと同じ測定が、患者からの GCF および血清/血漿サンプルに対して実行されます。

PBMC 内の機能的オートファゴソームの定量化は、メーカーの手順に従い、CYTO-ID® オートファジー検出キットを備えた BD Accuri 機器のフローサイトメトリーを使用して実行されます。 並行して、全血サンプルの白血球を酸化還元状態検出蛍光プローブとともに 15 分間インキュベートし、その後フローサイトメトリーを使用して分析します。 さらに、分化クラスター (CD) 抗原検出、CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 および CD14/CD16 に基づくフローサイトメトリー用のマルチカラー パネルは、リンパ球 T 亜集団 (ナイーブ T 細胞) の割合を分析するように設計されます。それぞれ、血液サンプル中の単球亜集団（古典、非古典、中間）、（TN）、中央記憶（TCM）、エフェクター記憶（TEM）および最終分化（TEMRA）細胞）、および単球部分集団（古典的、非古典的、および中間）。 どちらの手順でも 10,000 件のイベントが取得され、パネル内のすべての蛍光色素結合抗体に対する単一染色と FMO コントロールが実行されて、適切な補正が確立され、陽性シグナルが定義されます。

倒立顕微鏡に接続された平行プレート フロー チャンバーにより、研究者は in vitro で好中球と内皮細胞の相互作用を測定できるようになります。 このシステムを通じて、患者から得られた白血球懸濁液は、血流を模擬した条件下で不死化内皮細胞（HUVEC/TERT 2）の単層上に灌流されます。 ビデオは後で分析され、以前に記載されているように、流れ、回転速度、および内皮細胞への白血球の強固な接着が決定されます（Antiaxisants. 2020 8 11;9(8):734)。

遺伝子発現レベルの変化は、nCounter® 用の Nanostring® テクノロジーを使用して評価されます。 要約すると、GeneAllR RibospinTM トータル キットを使用し、100 ～ 200 ng のトータル RNA (Diagnostica Longwood, S.L.) から開始して、PBMC からトータル RNA が抽出されます。差次的な遺伝子発現応答を分析し、多重代謝パネルを取得します。

miRNA (DEG) の差次的遺伝子発現解析では、miRNeasy 血清/血漿キット (Qiagen) を使用して RNA を抽出します。 短鎖 RNA 抽出後、TruSeq Small RNA ライブラリー調製キット (Illumina, Inc) を使用してシーケンス用にライブラリーを調製します。 ライブラリーは等モルでプールされ、Illumina Primer Premix を含む KAPA SYBR FAST Universal qPCR キットを使用して定量化され、Bioanalyzer (Agilent) を使用してグループサイズが測定されます。 最後に、グループの 2 ナノモルが、FISABIO 施設の 1% PhiX コントロールを備えた Illumina NovaSeq6000 プラットフォームで配列決定されます。 ライブラリーは、SP フローセル (Illumina, Inc) で 2x100 bp の化学反応を使用して配列決定されます。 多重化後、生データは「COMPSRA: a COMprehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis」パイプラインを使用して処理されます。

DNA は、QIAamp 血液試薬セット (QIAgen、ヒルデン、ドイツ) の「血液および体液プロトコル」に従って血漿からも抽出されます。 400 μL の血漿を各カラムに適用し、DNA を付属のバッファー 200 μL で溶出し、使用するまで -20℃ で保存します。 mtDNA は、循環 mtDNA レベルを取得するための特定のプライマーを使用した逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) で定量されます。

データ分析は SPSS 17.0 で実行されます。 グループは、パラメトリック データとノンパラメトリック データに対してそれぞれ対応のないスチューデントの t 検定またはマンホイットニー U 検定を使用して比較されます。 介入後の変化は、変数の分布に応じて、対応のあるスチューデントの t 検定またはウィルコクソン検定を使用して評価されます。 ピアソンまたはスピアマンの相関係数は、変数間の関連の強さを測定するために使用されます。 多変数回帰モデルでは、取得したデータに一次方程式を当てはめることにより、2 つ以上の説明変数 (独立変数) と応答変数 (従属変数) の関係が評価されます。 定性データはパーセンテージで表され、カイ二乗検定を使用して比率が比較されます。 すべての検定では 95% 信頼区間が使用され、p < 0.05 の場合、差異は統計的に有意であるとみなされます。