Ei-kirurgisen parodontaalihoidon vaikutus immuunijärjestelmään sukupuolen näkökulmasta

Potilailta kerätään veri-, ikenneste (GCF) ja sylkinäytteet lähtötilanteessa ja 12 viikkoa ei-kirurgisen parodontaalihoidon jälkeen. Paastoverinäytteistä (12 h) perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) ja neutrofiilifraktiot eristetään immunomagneettisella menetelmällä valmistajan ohjetta noudattaen, ja plasmaa ja seerumia säilytetään -80°C:ssa analyysiin asti. LUNA-FL:ää käytetään määrittämään solujen lukumäärä ja elinkelpoisuus (akridiinioranssi ja propidiumjodidin kaksoisvärjäys) solunäytteistä. GCF-näytteet kerätään kahtena kappaleena työntämällä varovasti steriilit paperipisteet parodontaalitaskuun 1 mm 30 sekunnin ajaksi. Tilavuus määritetään käyttämällä Periotron 8000 -laitetta ja säilytetään -80 °C:ssa tulevia määrityksiä varten. Stimuloimaton sylki kerätään RNaasi-vapaisiin putkiin yskänpoistolla, ja sentrifugoinnin jälkeen supernatantti säilytetään -80 °C:ssa mikro-RNA (miRNA) -analyysiä varten.

Kliiniset periodontaaliset parametrit mittaustaskujen syvyydestä (PD), kliinisen kiinnitystason millimetreinä (CAL), verenvuoto koetuksesta (BOP), Silnessin ja Löen yksinkertaistettu plakkiindeksi sekä Greenen ja Vermillionin yksinkertaistettu hammaskiven indeksi määritetään käyttämällä tavanomaista manuaalia. periodontaalinen koetin (UNC-15 PCP). Parodontaalitutkimus suoritetaan PD:n, CAL:n ja BOP:n mittaamiseksi kuudesta kohdasta hammasta kohti kaikille hampaille, lukuun ottamatta kolmatta poskihampaa, kuten aiemmin on kuvattu. Potilaita haastatellaan heidän sairaushistoriastaan, elämäntapoistaan ​​(tupakointi, hampaiden harjauksen tiheys, fyysinen aktiivisuus) ja sosiodemografisista ominaisuuksista. Paino, pituus ja verenpaine mitataan standardoiduilla menetelmillä. Hiilihydraattiaineenvaihdunnan biokemialliset parametrit - glukoosi, insuliini, glykoitu hemoglobiini (A1c) -, lipidiprofiili - kokonaiskolesteroli, LDL, HDL, triglyseridit (TG), apolipoproteiinit AI ja B -, nousevat tulehdus- ja kardiovaskulaariset riskimerkit - C-reaktiivinen proteiini ( CRP), C3c ja retinolia sitova proteiini 4 (RBP4) - ja täydellinen verenkuva määritetään sairaalan kliinisessä analyysipalvelussa.

Proteiinin ilmentymisen erojen havaitsemiseksi soluja inkuboidaan lyysipuskurissa proteaasin ja fosfataasin estäjien (RIPA-puskuri) kanssa 15 minuuttia 4 celsiusasteessa (°C). Supernatantti kerätään 15 minuutin sentrifugoinnin jälkeen 16 000 g:ssä. Proteiinin kokonaispitoisuus määritetään käyttämällä bikinkoniinihappo (BCA) -proteiinimääritystä. Proteiinin 25 ug:n alikvootit erotetaan 8-16 % gradientti-SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirretään nitroselluloosakalvoille. Kohdeproteiinit havaitaan inkuboimalla kalvoja anti-aktiinin, JNK:n, NFkB:n, MCP1:n, GPX-1:n, NLRP3:n, ASC:n, prokaspaasi 1:n, kaspaasi 1:n, NADPH-oksidaasin, katalaasin, GPX1:n, SOD1:n, Beclinin, ATG5-ATG12:n, p6:n kanssa. , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alfa, ATF6, CHOP, PGC1 alfa, mTFA, VDAC, kompleksi I, II, III, IV ja V. Proteiinisignaali havaitaan kemiluminesenssilla ja analysoidaan densitometrisesti.

Tulehduskompleksin kokoaminen (aktivoinnin ensimmäinen vaihe) NLRP3-ASC:n yhteispaikannustutkimuksilla PBMC:issä suoritetaan käyttämällä konfokaali- ja/tai fluoresenssimikroskopiaa. Lyhyesti sanottuna PBMC:t kylvetään peitinlaseille, jotka on päällystetty poly-D-lysiinillä, kiinnitetty 4-prosenttisella paraformaldehydillä (PFA) 20 minuutin ajan, tehty läpäiseväksi Triton X-100:lla 20 minuuttia ja estetty fosfaattipuskuroidulla suolaliuospuskurilla - naudan seerumialbumiinilla ( PBS-BSA) 3 % 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Hybridisaatio spesifisillä primaarisilla vasta-aineilla (laimennettu PBS-BSA:lla 1 %) suoritetaan yön yli 4 ºC:ssa ja sitten AlexaFluor-fluoroforeihin konjugoituja sekundaarisia vasta-aineita inkuboidaan 1 tunti pimeässä huoneenlämpötilassa. Värjätyt näytteet siirretään peitinlasi mikroskoopin objektilasille ja säilytetään haalistumista estävässä fluoresenssikiinnitysväliaineessa.

Verenkierrossa olevien sytokiinien, adheesiomolekyylien ja seerumin oksidatiivisen stressin merkkiaineiden tasot mitataan seeruminäytteistä, mutta eritystutkimuksia varten 1 x 10^6 PBMC:tä inkuboidaan aiemmin 1 ml:ssa RPMI:tä, jossa on 10 % naudan sikiön seerumia (FBS) 4 tunnin ajan (37°). C, 5 % C02) supernatantin saamiseksi. Sekä seerumit että supernatantit analysoidaan Luminex® 200 -analysaattorijärjestelmällä Milliplex® MAP Kitin valmistajan menettelyn mukaisesti. Nämä samat määritykset tehdään potilaiden GCF- ja seerumi/plasmanäytteistä.

Funktionaalisten autofagosomien kvantifiointi PBMC:issä suoritetaan virtaussytometriaa käyttäen BD Accuri -laitteistollamme CYTO-ID® Autofagian tunnistussarjalla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Samanaikaisesti kokoverinäytteistä saatuja leukosyyttejä inkuboidaan redox-tilan havaitsevien fluoresoivien koettimien kanssa 15 minuutin ajan ja sitten ne analysoidaan virtaussytometriaa käyttäen. Lisäksi suunnitellaan moniväriset paneelit virtaussytometriaa varten, jotka perustuvat differentiaatioantigeeniklusterin (CD) havaitsemiseen, CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 ja CD14/CD16 analysoimaan lymfosyytti-T-alapopulaatioiden (naiivit T-solut) prosenttiosuutta. (TN), keskusmuisti (TCM), efektorimuisti (TEM) ja terminaalisesti erilaistuneet (TEMRA) solut) ja monosyyttien alapopulaatiot (klassinen, ei-klassinen ja keskitaso), vastaavasti verinäytteissä. Molemmissa toimenpiteissä hankitaan 10 000 tapahtumaa ja yksittäinen värjäys ja FMO-kontrollit kaikille paneelien fluorokromikonjugoiduille vasta-aineille riittävän kompensaation ja positiivisten signaalien määrittämiseksi.

Rinnakkaislevyvirtauskammio, joka on yhdistetty käänteiseen mikroskooppiin, antaa tutkijoille mahdollisuuden mitata neutrofiilien ja endoteelisolujen vuorovaikutuksia in vitro. Tämän järjestelmän kautta potilailta saatu leukosyyttisuspensio perfusoidaan yksikerroksisen immortalisoitujen endoteelisolujen (HUVEC/TERT 2) päälle verenvirtausta simuloivissa olosuhteissa. Videot analysoidaan myöhemmin, jotta voidaan määrittää virtaus, rullausnopeus ja leukosyyttien luja adheesio endoteelisoluihin, kuten aiemmin on kuvattu (Antioksidantit. 2020, 11. elokuuta; 9(8):734).

Geenien ilmentymistasojen muutokset arvioidaan Nanostring®-teknologialla nCounter®:lle. Yhteenvetona voidaan todeta, että kokonais-RNA uutetaan PBMC:istä käyttämällä GeneAllR RibospinTM -kokonaispakkausta ja alkaen 100-200 ng:sta kokonais-RNA:ta, Diagnostica Longwood, S.L. analysoi differentiaalisen geeniekspressiovasteen, jolloin saadaan moninkertaisen aineenvaihdunnan paneeli.

MiRNA:iden (DEG) differentiaalista geeniekspressioanalyysiä varten RNA uutetaan käyttämällä miRNeasy Serum/Plasma -kittiä (Qiagen). Lyhytketjuisen RNA:n uuton jälkeen kirjastot valmistellaan sekvensointia varten käyttämällä TruSeq Small RNA -kirjaston valmistussarjaa (Illumina, Inc). Kirjastot yhdistetään ekvimolaarisesti ja kvantifioidaan käyttämällä KAPA SYBR FAST Universal qPCR -sarjaa Illumina Primer Premixin kanssa, ja ryhmän koko mitataan käyttämällä Bioanalyzer-laitetta (Agilent). Lopuksi 2 nanomoolia ryhmästä sekvensoidaan Illumina NovaSeq6000 -alustalla 1 % PhiX-kontrollilla FISABIO-tiloissa. Kirjastot sekvensoidaan käyttämällä 2 x 100 bp:n kemiaa SP-virtauskennossa (Illumina, Inc). Multipleksoinnin jälkeen raakadata käsitellään käyttämällä "COMPSRA: a Comprehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis" -liukuhihnaa.

DNA uutetaan myös plasmasta QIAamp-verireagenssisarjan "veri- ja ruumiinnesteprotokollan" mukaisesti (QIAgen, Hilden, Saksa); 400 µl plasmaa levitetään jokaiseen pylvääseen, DNA eluoidaan 200 µl:ssa mukana toimitettua puskuria ja säilytetään -20 °C:ssa käyttöön asti. mtDNA kvantifioidaan käänteistranskriptio-kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (RT-qPCR) käyttämällä spesifisiä alukkeita verenkierron mtDNA-tasojen saamiseksi.

Tietojen analysointi suoritetaan SPSS 17.0:lla. Ryhmiä verrataan käyttämällä parittomia Studentin t-testejä tai Mann-Whitneyn U-testejä parametrisille ja ei-parametrisille tiedoille, vastaavasti. Intervention jälkeisiä muutoksia arvioidaan käyttämällä parillisia Studentin t-testejä tai Wilcoxon-testejä riippuen muuttujajakaumasta. Pearsonin tai Spearmanin korrelaatiokertoimia käytetään mittaamaan muuttujien välisen assosiaatiovahvuuden. Monimuuttujaregressiomalleissa kahden tai useamman selittävän muuttujan (riippumattoman muuttujan) ja vastemuuttujan (riippuvaisen muuttujan) välinen suhde arvioidaan sovittamalla saatuun dataan lineaarinen yhtälö. Laadulliset tiedot ilmaistaan ​​prosentteina ja suhteita verrataan khin neliötestillä. Kaikissa testeissä käytetään 95 %:n luottamusväliä, ja eroja pidetään tilastollisesti merkittävinä, kun p <0,05.