Efeito do tratamento periodontal não cirúrgico no sistema imunológico do ponto de vista de gênero

Amostras de sangue, fluido crevicular gengival (GCF) e saliva serão coletadas dos pacientes no início do estudo e 12 semanas após o tratamento periodontal não cirúrgico. A partir de amostras de sangue em jejum (12h), células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e frações de neutrófilos serão isoladas por método imunomagnético, seguindo protocolo do fabricante, e plasma e soro serão armazenados a -80°C até a análise. O LUNA-FL será usado para determinar a contagem e viabilidade celular (coração dupla com laranja de acridina e iodeto de propídio) em amostras de células. Amostras GCF serão coletadas em duplicata, inserindo cuidadosamente pontas de papel estéreis na bolsa periodontal de 1 mm por 30 s. O volume será determinado utilizando o Periotron 8000 e armazenado a -80°C para determinações futuras. A saliva não estimulada será coletada em tubos livres de RNase por expectoração e, após centrifugação, o sobrenadante será armazenado a -80°C para análise de microRNA (miRNA).

Parâmetros clínicos periodontais de profundidade de bolsas de sondagem (PD), milímetros de nível de inserção clínica (CAL), sangramento à sondagem (BOP), índice de placa simplificado de Silness e Löe e índice de cálculo simplificado de Greene e Vermillion serão determinados usando um manual convencional sonda periodontal (UNC-15 PCP). Um exame periodontal será realizado para medir PD, CAL e BOP em seis locais por dente para todos os dentes, excluindo terceiros molares, conforme descrito anteriormente. Os pacientes serão entrevistados sobre seu histórico médico, hábitos de vida (tabagismo, frequência de escovação dentária, atividade física) e características sociodemográficas. Peso, altura e pressão arterial serão medidos usando métodos padronizados. Parâmetros bioquímicos do metabolismo de carboidratos - glicose, insulina, hemoglobina glicada (A1c) -, perfil lipídico - colesterol total, LDL, HDL, triglicerídeos (TG), apolipoproteínas AI e B -, marcadores emergentes de risco inflamatório e cardiovascular - Proteína C Reativa ( PCR), C3c e proteína ligadora de retinol 4 (RBP4) -, e hemograma completo serão determinados no Serviço de Análises Clínicas do hospital.

Para detecção de diferenças na expressão proteica, as células serão incubadas em tampão de lise com inibidores de protease e fosfatase (tampão RIPA) por 15 minutos a 4 graus Celsius (°C). O sobrenadante será coletado após centrifugação por 15 minutos a 16.000g. A concentração total de proteína será quantificada usando um ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA). Alíquotas de 25 µg de proteína serão resolvidas em géis de SDS-poliacrilamida com gradiente de 8-16% e transferidas para membranas de nitrocelulose. As proteínas alvo serão detectadas incubando as membranas com anti-actina, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, procaspase 1, caspase 1, NADPH oxidase, catalase, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alfa, ATF6, CHOP, PGC1 alfa, mTFA, VDAC, Complexo I, II, III, IV e V. O sinal proteico será detectado por quimioluminescência e analisado por densitometria.

A montagem do complexo inflamassoma (primeira etapa de ativação) através de estudos de co-localização de NLRP3-ASC em PBMCs será realizada utilizando microscopia confocal e/ou de fluorescência. Resumidamente, as PBMCs serão semeadas em lamínulas revestidas com Poli-D-Lisina, fixadas com paraformaldeído (PFA) 4% por 20 minutos, permeabilizadas com Triton X-100 por 20 minutos e bloqueadas com tampão salino tamponado com fosfato-álbum de soro bovino ( PBS-BSA) 3% durante 1 hora à temperatura ambiente. A hibridização com anticorpos primários específicos (diluídos em PBS-BSA 1%) será realizada durante a noite a 4 ºC e em seguida, os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos AlexaFluor serão incubados por 1 hora no escuro em temperatura ambiente. Amostras coradas serão transferidas da lamela para lâmina de microscópio e conservadas em meio de montagem de fluorescência anti-desbotamento.

Os níveis circulantes de citocinas, moléculas de adesão e marcadores séricos de estresse oxidativo serão medidos em amostras de soro, mas para estudos de secretoma 1x10^6 PBMCs serão previamente incubados em 1 mL de RPMI com 10% de soro bovino fetal (FBS) por 4 horas (37° C, 5% CO2) para obter o sobrenadante. Tanto os soros quanto os sobrenadantes serão analisados ​​​​com um sistema analisador Luminex® 200 seguindo o procedimento do fabricante do kit Milliplex® MAP. Essas mesmas determinações serão realizadas em GCF e amostras de soro/plasma de pacientes.

A quantificação de autofagossomos funcionais em PBMCs será realizada utilizando citometria de fluxo em nosso equipamento BD Accuri com o kit de detecção de autofagia CYTO-ID® seguindo procedimento do fabricante. Paralelamente, leucócitos de amostras de sangue total serão incubados com status redox detectando sondas fluorescentes por 15 minutos e depois serão analisados ​​​​por citometria de fluxo. Além disso, painéis multicoloridos para citometria de fluxo baseados na detecção de antígenos de cluster de diferenciação (CD), CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 e CD14/CD16, serão projetados para analisar a porcentagem de subpopulações de linfócitos T (células T virgens (TN), células de memória central (TCM), memória efetora (TEM) e células terminalmente diferenciadas (TEMRA)) e subpopulações de monócitos (clássicas, não clássicas e intermediárias), respectivamente em amostras de sangue. Em ambos os procedimentos, 10.000 eventos serão adquiridos e coloração única e controles FMO para todos os anticorpos conjugados com fluorocromo nos painéis serão realizados para estabelecer compensação adequada e definir sinais positivos.

Uma câmara de fluxo de placas paralelas, conectada a um microscópio invertido, permitirá aos pesquisadores medir as interações entre neutrófilos e células endoteliais in vitro. Através deste sistema, a suspensão de leucócitos obtida dos pacientes será perfundida sobre uma monocamada de células endoteliais imortalizadas (HUVEC/TERT 2) em condições que simulam o fluxo sanguíneo. Os vídeos serão analisados ​​posteriormente para determinar o fluxo, a velocidade de rolamento e a adesão firme dos leucócitos às células endoteliais, conforme descrito anteriormente (Antioxidantes. 11 de agosto de 2020;9(8):734).

Mudanças nos níveis de expressão gênica serão avaliadas usando a tecnologia Nanostring® para nCounter®. Resumindo, o RNA total será extraído de PBMCs usando o kit total GeneAllR RibospinTM, e a partir de 100-200 ng de RNA total, Diagnostica Longwood, S.L. analisará a resposta diferencial da expressão gênica, obtendo assim o painel do metabolismo multiplex.

Para análise diferencial de expressão gênica de miRNAs (DEGs), o RNA será extraído utilizando o kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). Após a extração de RNA de cadeia curta, as bibliotecas serão preparadas para sequenciamento usando o kit de preparação de biblioteca TruSeq Small RNA (Illumina, Inc). As bibliotecas serão agrupadas equimolarmente e quantificadas usando o kit KAPA SYBR FAST Universal qPCR com Illumina Primer Premix, e o tamanho do grupo será medido usando um Bioanalyzer (Agilent). Por fim, 2 nanomoles do grupo serão sequenciados na plataforma Illumina NovaSeq6000 com controle PhiX de 1% nas instalações da FISABIO. As bibliotecas serão sequenciadas usando química de 2x100 pb em uma célula de fluxo SP (Illumina, Inc). Após a multiplexação, os dados brutos serão processados ​​usando o pipeline "COMPSRA: uma plataforma abrangente para análise de dados pequenos RNA-Seq".

O DNA também será extraído do plasma de acordo com o "protocolo de sangue e fluidos corporais" do conjunto de reagentes de sangue QIAamp (QIAgen, Hilden, Alemanha); 400 μL de plasma serão aplicados em cada coluna, o DNA será eluído em 200 μL de tampão fornecido e será armazenado a -20°C até o uso. O mtDNA será quantificado por reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR) utilizando primers específicos para obtenção dos níveis circulantes de mtDNA.

A análise dos dados será realizada com SPSS 17.0. Os grupos serão comparados usando testes t de Student não pareados ou testes U de Mann-Whitney para dados paramétricos e não paramétricos, respectivamente. As mudanças após a intervenção serão avaliadas por meio de testes t de Student pareados ou testes de Wilcoxon, dependendo da distribuição da variável. Coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman serão utilizados para medir a força de associação entre as variáveis. Nos modelos de regressão multivariada, a relação entre duas ou mais variáveis ​​explicativas (variáveis ​​independentes) e uma variável resposta (variável dependente) será avaliada ajustando uma equação linear aos dados obtidos. Os dados qualitativos serão expressos em porcentagens e as proporções serão comparadas por meio do teste qui-quadrado. Todos os testes utilizarão intervalo de confiança de 95%, e as diferenças serão consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.