Влияние нехирургического пародонтологического лечения на иммунную систему с гендерной точки зрения

Образцы крови, десневой жидкости (GCF) и слюны будут взяты у пациентов исходно и через 12 недель после нехирургического пародонтологического лечения. Из проб крови натощак (12 часов) мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и фракции нейтрофилов будут выделены с использованием иммуномагнитного метода в соответствии с протоколом производителя, а плазма и сыворотка будут храниться при -80°C до проведения анализа. LUNA-FL будет использоваться для определения количества и жизнеспособности клеток (двойное окрашивание акридиновым оранжевым и йодидом пропидия) в образцах клеток. Образцы GCF будут собираться в двух экземплярах путем осторожного введения стерильных бумажных штифтов в пародонтальный карман на 1 мм на 30 с. Объем будет определяться с использованием Periotron 8000 и храниться при -80°C для будущих определений. Нестимулированную слюну собирают в пробирки без РНКазы путем отхаркивания, а после центрифугирования супернатант хранят при -80°C для анализа микроРНК (миРНК).

Клинические пародонтальные параметры глубины зондирующих карманов (PD), миллиметров клинического уровня прикрепления (CAL), кровотечения при зондировании (BOP), упрощенного индекса зубного налета Силнесса и Лё, а также упрощенного индекса зубного камня Грина и Вермиллиона будут определяться с использованием обычного руководства. пародонтальный зонд (UNC-15 PCP). Будет проведено пародонтологическое обследование для измерения PD, CAL и BOP в шести местах на каждый зуб для всех зубов, за исключением третьих моляров, как описано ранее. Пациентов будут опросить об их истории болезни, образе жизни (курение, частота чистки зубов, физическая активность) и социально-демографических характеристиках. Вес, рост и артериальное давление будут измеряться стандартизированными методами. Биохимические показатели углеводного обмена - глюкоза, инсулин, гликированный гемоглобин (А1с) -, липидный профиль - общий холестерин, ЛПНП, ЛПВП, триглицериды (ТГ), аполипопротеины АИ и В -, новые маркеры воспалительного и сердечно-сосудистого риска - С-реактивный белок ( CRP), C3c и ретинол-связывающий белок 4 (RBP4) - и общий анализ крови будут определяться в службе клинического анализа больницы.

Для обнаружения различий в экспрессии белка клетки инкубируют в буфере для лизиса с ингибиторами протеаз и фосфатаз (буфер RIPA) в течение 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия (°C). Супернатант собирают после центрифугирования в течение 15 минут при 16 000 g. Общая концентрация белка будет определена количественно с использованием анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA). Аликвоты по 25 мкг белка разделяют на 8-16% градиентных гелях ДСН-полиакриламида и переносят на нитроцеллюлозные мембраны. Целевые белки будут обнаружены путем инкубации мембран с антиактином, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, прокаспазой 1, каспазой 1, НАДФН-оксидазой, каталазой, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62. , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 альфа, ATF6, CHOP, PGC1 альфа, mTFA, VDAC, комплекс I, II, III, IV и V. Сигнал белка будет обнаружен с помощью хемилюминесценции и проанализирован с помощью денситометрии.

Сборка воспалительного комплекса (первая стадия активации) посредством исследований совместной локализации NLRP3-ASC в РВМС будет проводиться с использованием конфокальной и/или флуоресцентной микроскопии. Вкратце, РВМС высевают на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином, фиксируют 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 минут, пермеабилизируют тритоном X-100 в течение 20 минут и блокируют фосфатно-солевым буфером - альбуном бычьей сыворотки ( PBS-BSA) 3% в течение 1 часа при комнатной температуре. Гибридизацию со специфическими первичными антителами (разбавленными в PBS-BSA 1%) будут проводить в течение ночи при 4 ºC, а затем вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами AlexaFluor, будут инкубироваться в течение 1 часа в темноте при комнатной температуре. Окрашенные образцы будут перенесены с покровного стекла на предметное стекло микроскопа и сохранены в среде, устойчивой к выцветанию флуоресценции.

Уровни циркулирующих цитокинов, молекул адгезии и маркеров окислительного стресса в сыворотке будут измеряться в образцах сыворотки, но для секретомных исследований 1x10^6 РВМС будут предварительно инкубированы в 1 мл RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в течение 4 часов (37°). C, 5% CO2) для получения надосадочной жидкости. Как сыворотки, так и супернатанты будут анализироваться с помощью анализаторной системы Luminex® 200 в соответствии с процедурой производителя набора Milliplex® MAP. Эти же определения будут проводиться на образцах ЗКФ и сыворотки/плазмы пациентов.

Количественное определение функциональных аутофагосом в РВМС будет проводиться с использованием проточной цитометрии на нашем оборудовании BD Accuri с набором для обнаружения аутофагии CYTO-ID® в соответствии с процедурой производителя. Параллельно лейкоциты из образцов цельной крови будут инкубироваться с помощью флуоресцентных зондов, определяющих окислительно-восстановительный статус, в течение 15 минут, а затем они будут проанализированы с помощью проточной цитометрии. Кроме того, будут разработаны многоцветные панели для проточной цитометрии, основанные на обнаружении антигенов кластера дифференцировки (CD), CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 и CD14/CD16, для анализа процента субпопуляций Т-лимфоцитов (наивных Т-клеток). (TN), центральная память (TCM), эффекторная память (TEM) и терминально дифференцированные (TEMRA) клетки) и субпопуляции моноцитов (классические, неклассические и промежуточные) соответственно в образцах крови. В обеих процедурах будет получено 10 000 событий, и будет выполнено однократное окрашивание и контроль FMO для всех антител, конъюгированных с флуорохромом, в панелях, чтобы установить адекватную компенсацию и определить положительные сигналы.

Проточная камера с параллельными пластинами, подключенная к инвертированному микроскопу, позволит исследователям измерять взаимодействия нейтрофилов и эндотелиальных клеток in vitro. С помощью этой системы суспензия лейкоцитов, полученная от пациентов, будет перфузироваться через монослой иммортализованных эндотелиальных клеток (HUVEC/TERT 2) в условиях, имитирующих кровоток. Видеозаписи будут впоследствии проанализированы для определения потока, скорости вращения и прочной адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам, как описано ранее (Антиоксиданты. 11 августа 2020 г.;9(8):734).

Изменения уровня экспрессии генов будут оцениваться с использованием технологии Nanostring® для nCounter®. Подводя итог, можно сказать, что общая РНК будет экстрагирована из РВМС с использованием общего набора GeneAllR RibospinTM, начиная со 100-200 нг общей РНК, Diagnostica Longwood, S.L. проанализирует реакцию дифференциальной экспрессии генов, получив таким образом мультиплексную панель метаболизма.

Для анализа дифференциальной экспрессии генов микроРНК (DEG) РНК будет экстрагироваться с использованием набора miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). После экстракции короткоцепочечной РНК библиотеки будут подготовлены для секвенирования с использованием набора для подготовки библиотеки малых РНК TruSeq (Illumina, Inc). Библиотеки будут объединены эквимолярно и количественно оценены с использованием универсального набора для qPCR KAPA SYBR FAST с премиксом Illumina Primer Premix, а размер группы будет измерен с помощью биоанализатора (Agilent). Наконец, 2 наномоля группы будут секвенированы на платформе Illumina NovaSeq6000 с 1% контролем PhiX в помещениях FISABIO. Библиотеки будут секвенированы с использованием химического состава 2x100 п.о. в проточной ячейке SP (Illumina, Inc). После мультиплексирования необработанные данные будут обработаны с использованием конвейера «COMPSRA: комплексная платформа для анализа данных малых РНК-сек».

ДНК также будет экстрагирована из плазмы в соответствии с «протоколом крови и биологических жидкостей» набора реагентов для крови QIAamp (QIAgen, Хильден, Германия); На каждую колонку наносят 400 мкл плазмы, ДНК элюируют в 200 мкл поставляемого буфера и хранят при -20°C до использования. мтДНК будет количественно оценена с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR) с использованием специфических праймеров для определения уровней циркулирующей мтДНК.

Анализ данных будет выполнен с помощью SPSS 17.0. Группы будут сравниваться с использованием непарных t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни для параметрических и непараметрических данных соответственно. Изменения после вмешательства будут оцениваться с использованием парных t-критерий Стьюдента или критериев Уилкоксона, в зависимости от распределения переменных. Коэффициенты корреляции Пирсона или Спирмена будут использоваться для измерения силы связи между переменными. В моделях многомерной регрессии взаимосвязь между двумя или более объясняющими переменными (независимыми переменными) и переменной отклика (зависимой переменной) будет оцениваться путем подгонки линейного уравнения к полученным данным. Качественные данные будут выражены в процентах, а пропорции будут сравниваться с использованием критерия Хи-квадрат. Во всех тестах будет использоваться доверительный интервал 95%, а различия будут считаться статистически значимыми, если p <0,05.