Effetto del trattamento parodontale non chirurgico sul sistema immunitario da una prospettiva di genere

Campioni di sangue, fluido crevicolare gengivale (GCF) e saliva verranno raccolti dai pazienti al basale e 12 settimane dopo il trattamento parodontale non chirurgico. Dai campioni di sangue a digiuno (12 ore), le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e le frazioni di neutrofili verranno isolate utilizzando un metodo immunomagnetico, seguendo il protocollo del produttore, e il plasma e il siero verranno conservati a -80°C fino all'analisi. LUNA-FL sarà utilizzato per determinare la conta cellulare e la vitalità (doppia colorazione con arancio di acridina e ioduro di propidio) nei campioni cellulari. I campioni GCF verranno raccolti in duplicato inserendo con cura punte di carta sterili nella tasca parodontale da 1 mm per 30 s. Il volume verrà determinato utilizzando Periotron 8000 e conservato a -80°C per determinazioni future. La saliva non stimolata verrà raccolta in provette prive di RNasi mediante espettorazione e, dopo la centrifugazione, il surnatante verrà conservato a -80°C per l'analisi dei microRNA (miRNA).

I parametri clinici parodontali relativi alla profondità di sondaggio delle tasche (PD), ai millimetri del livello di attacco clinico (CAL), al sanguinamento al sondaggio (BOP), all'indice di placca semplificato di Silness e Löe e all'indice di calcolo semplificato di Greene e Vermillion saranno determinati utilizzando un manuale convenzionale sonda parodontale (UNC-15 PCP). Verrà eseguito un esame parodontale per misurare PD, CAL e BOP in sei siti per dente per tutti i denti, esclusi i terzi molari, come descritto in precedenza. I pazienti verranno intervistati sulla loro storia medica, sulle abitudini di vita (fumo, frequenza di lavarsi i denti, attività fisica) e sulle caratteristiche sociodemografiche. Peso, altezza e pressione sanguigna saranno misurati utilizzando metodi standardizzati. Parametri biochimici del metabolismo dei carboidrati - glucosio, insulina, emoglobina glicata (A1c) -, profilo lipidico - colesterolo totale, LDL, HDL, trigliceridi (TG), apolipoproteine ​​AI e B -, marcatori emergenti di rischio infiammatorio e cardiovascolare - Proteina C-reattiva ( CRP), C3c e proteina legante il retinolo 4 (RBP4) - e l'emocromo completo saranno determinati presso il servizio di analisi cliniche dell'ospedale.

Per rilevare le differenze nell'espressione proteica, le cellule verranno incubate in tampone di lisi con inibitori della proteasi e della fosfatasi (tampone RIPA) per 15 minuti a 4 gradi Celsius (°C). Il surnatante verrà raccolto dopo centrifugazione per 15 minuti a 16.000 g. La concentrazione proteica totale sarà quantificata utilizzando un dosaggio proteico dell'acido bicinconinico (BCA). Aliquote di 25 µg di proteine ​​verranno sciolte su gel di poliacrilammide SDS con gradiente 8-16% e trasferite su membrane di nitrocellulosa. Le proteine ​​bersaglio verranno rilevate incubando le membrane con anti-actina, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, procaspase 1, caspasi 1, NADPH ossidasi, catalasi, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alfa, ATF6, CHOP, PGC1 alfa, mTFA, VDAC, Complesso I, II, III, IV e V. Il segnale proteico verrà rilevato mediante chemiluminescenza e analizzato mediante densitometria.

L'assemblaggio del complesso dell'inflammasoma (primo stadio di attivazione) attraverso studi di co-localizzazione di NLRP3-ASC nelle PBMC sarà condotto utilizzando la microscopia confocale e/o a fluorescenza. In breve, le PBMC verranno seminate su vetrini rivestiti con poli-D-lisina, fissati con paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti, permeabilizzati con Triton X-100 per 20 minuti e bloccati con tampone salino tamponato con fosfato-albume di siero bovino ( PBS-BSA) 3% per 1 ora a temperatura ambiente. L'ibridazione con anticorpi primari specifici (diluiti in PBS-BSA 1%) verrà effettuata overnight a 4 ºC e quindi gli anticorpi secondari coniugati con i fluorofori AlexaFluor verranno incubati per 1 ora al buio a temperatura ambiente. I campioni colorati verranno trasferiti dal vetrino coprioggetto su un vetrino da microscopio e conservati in un mezzo di montaggio per fluorescenza anti-sbiadimento.

I livelli circolanti di citochine, molecole di adesione e marcatori di stress ossidativo sierico saranno misurati nei campioni di siero, ma per gli studi sul secretoma 1x10^6 PBMC saranno precedentemente incubati in 1 mL RPMI con siero bovino fetale al 10% (FBS) per 4 ore (37° C, 5% CO2) per ottenere il surnatante. Sia i sieri che i surnatanti verranno analizzati con un sistema di analisi Luminex® 200 seguendo la procedura del produttore del kit Milliplex® MAP. Queste stesse determinazioni verranno effettuate su campioni di GCF e di siero/plasma dei pazienti.

La quantificazione degli autofagosomi funzionali nei PBMC verrà eseguita utilizzando la citometria a flusso sulla nostra apparecchiatura BD Accuri con il kit di rilevamento dell'autofagia CYTO-ID® seguendo la procedura del produttore. In parallelo, i leucociti provenienti da campioni di sangue intero verranno incubati con sonde fluorescenti che rilevano lo stato redox per 15 minuti e quindi verranno analizzati utilizzando la citometria a flusso. Inoltre, un pannello multicolore per la citometria a flusso basato sul rilevamento degli antigeni del cluster di differenziazione (CD), CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 e CD14/CD16, sarà progettato per analizzare la percentuale di sottopopolazioni di linfociti T (cellule T naive (TN), memoria centrale (TCM), memoria effettrice (TEM) e cellule differenziate terminalmente (TEMRA)) e sottopopolazioni di monociti (classiche, non classiche e intermedie), rispettivamente nei campioni di sangue. In entrambe le procedure verranno acquisiti 10000 eventi e verranno eseguite colorazioni singole e controlli FMO per tutti gli anticorpi coniugati con fluorocromo nei pannelli per stabilire un'adeguata compensazione e definire segnali positivi.

Una camera di flusso a piastre parallele, collegata a un microscopio invertito, consentirà ai ricercatori di misurare le interazioni tra cellule neutrofili e endoteliali in vitro. Attraverso questo sistema, la sospensione leucocitaria ottenuta dai pazienti verrà perfusa su un monostrato di cellule endoteliali immortalizzate (HUVEC/TERT 2) in condizioni che simulano il flusso sanguigno. I video verranno successivamente analizzati per determinare il flusso, la velocità di rotolamento e la salda adesione dei leucociti alle cellule endoteliali, come precedentemente descritto (Antiossidanti. 2020 11 agosto;9(8):734).

I cambiamenti nei livelli di espressione genetica saranno valutati utilizzando la tecnologia Nanostring® per nCounter®. Per riassumere, l'RNA totale sarà estratto dai PBMC utilizzando il kit totale GeneAllR RibospinTM e partendo da 100-200 ng di RNA totale, Diagnostica Longwood, S.L. analizzerà la risposta differenziale dell'espressione genica, ottenendo così il pannello del metabolismo multiplex.

Per l'analisi differenziale dell'espressione genica dei miRNA (DEG), l'RNA sarà estratto utilizzando il kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). Dopo l'estrazione dell'RNA a catena corta, le librerie verranno preparate per il sequenziamento utilizzando il kit di preparazione delle librerie TruSeq Small RNA (Illumina, Inc). Le librerie verranno raggruppate in modo equimolare e quantificate utilizzando il kit qPCR universale KAPA SYBR FAST con Illumina Primer Premix e la dimensione del gruppo sarà misurata utilizzando un bioanalizzatore (Agilent). Infine, 2 nanomoli del gruppo saranno sequenziate sulla piattaforma Illumina NovaSeq6000 con un controllo PhiX all'1% nelle strutture FISABIO. Le librerie verranno sequenziate utilizzando la chimica 2x100 bp in una cella a flusso SP (Illumina, Inc). Dopo il multiplexing, i dati grezzi verranno elaborati utilizzando la pipeline "COMPSRA: a COMprehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis".

Il DNA sarà inoltre estratto dal plasma secondo il "protocollo sangue e fluidi corporei" del set di reagenti sangue QIAamp (QIAgen, Hilden, Germania); Ad ogni colonna verranno applicati 400 μL di plasma, il DNA verrà eluito in 200 μL di tampone fornito e verrà conservato a -20°C fino al momento dell'utilizzo. Il mtDNA sarà quantificato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR) utilizzando primer specifici per ottenere i livelli di mtDNA circolanti.

L'analisi dei dati verrà eseguita con SPSS 17.0. I gruppi verranno confrontati utilizzando il test t di Student non accoppiato o il test U di Mann-Whitney per dati parametrici e non parametrici, rispettivamente. I cambiamenti dopo l'intervento verranno valutati utilizzando il test t di Student o il test di Wilcoxon, a seconda della distribuzione delle variabili. I coefficienti di correlazione di Pearson o Spearman verranno utilizzati per misurare la forza dell'associazione tra le variabili. Nei modelli di regressione multivariabile, la relazione tra due o più variabili esplicative (variabili indipendenti) e una variabile di risposta (variabile dipendente) verrà valutata adattando un'equazione lineare ai dati ottenuti. I dati qualitativi saranno espressi in percentuali e le proporzioni saranno confrontate utilizzando un test Chi-quadrato. Tutti i test utilizzeranno un intervallo di confidenza del 95% e le differenze saranno considerate statisticamente significative quando p <0,05.