Effet du traitement parodontal non chirurgical sur le système immunitaire du point de vue du genre

Des échantillons de sang, de liquide creviculaire gingival (GCF) et de salive seront prélevés sur les patients au départ et 12 semaines après un traitement parodontal non chirurgical. À partir d'échantillons de sang à jeun (12h), les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et les fractions de neutrophiles seront isolées à l'aide d'une méthode immunomagnétique, en suivant le protocole du fabricant, et le plasma et le sérum seront conservés à -80°C jusqu'à analyse. LUNA-FL sera utilisé pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité (double coloration à l'orange d'acridine et à l'iodure de propidium) dans des échantillons de cellules. Les échantillons GCF seront collectés en double en insérant soigneusement des pointes de papier stériles dans la poche parodontale de 1 mm pendant 30 s. Le volume sera déterminé à l'aide du Periotron 8000 et stocké à -80°C pour des déterminations futures. La salive non stimulée sera collectée dans des tubes sans RNase par expectoration, et après centrifugation, le surnageant sera conservé à -80°C pour l'analyse des microARN (miARN).

Paramètres parodontaux cliniques de profondeur des poches de sondage (PD), millimètres de niveau d'attache clinique (CAL), saignement au sondage (BOP), indice de plaque simplifié de Silness et Löe et indice de calcul simplifié de Greene et Vermillion seront déterminés à l'aide d'un manuel conventionnel sonde parodontale (UNC-15 PCP). Un examen parodontal sera effectué pour mesurer PD, CAL et BOP sur six sites par dent pour toutes les dents, à l'exclusion des troisièmes molaires, comme décrit précédemment. Les patients seront interrogés sur leurs antécédents médicaux, leurs habitudes de vie (tabagisme, fréquence de brossage des dents, activité physique) et caractéristiques sociodémographiques. Le poids, la taille et la tension artérielle seront mesurés à l'aide de méthodes standardisées. Paramètres biochimiques du métabolisme des glucides - glucose, insuline, hémoglobine glyquée (A1c) -, profil lipidique - cholestérol total, LDL, HDL, triglycérides (TG), apolipoprotéines AI et B -, marqueurs émergents de risque inflammatoire et cardiovasculaire - Protéine C-Réactive ( CRP), C3c et protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4) -, et une formule sanguine complète sera déterminée au service d'analyse clinique de l'hôpital.

Pour la détection des différences d'expression des protéines, les cellules seront incubées dans un tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (tampon RIPA) pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius (°C). Le surnageant sera récupéré après centrifugation 15 minutes à 16 000 g. La concentration totale en protéines sera quantifiée à l'aide d'un test protéique à l'acide bicinchoninique (BCA). Des aliquotes de 25 µg de protéine seront résolues sur des gels SDS-polyacrylamide à gradient de 8 à 16 % et transférées sur des membranes de nitrocellulose. Les protéines cibles seront détectées en incubant les membranes avec anti-actine, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, procaspase 1, caspase 1, NADPH oxydase, catalase, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alpha, ATF6, CHOP, PGC1 alpha, mTFA, VDAC, Complexe I, II, III, IV et V. Le signal protéique sera détecté par chimiluminescence et analysé par densitométrie.

L'assemblage du complexe inflammatoire (première étape d'activation) grâce à des études de co-localisation de NLRP3-ASC dans les PBMC sera réalisé en utilisant la microscopie confocale et/ou à fluorescence. En bref, les PBMC seront ensemencées sur des lamelles recouvertes de Poly-D-Lysine, fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) 4% pendant 20 minutes, perméabilisées avec du Triton X-100 pendant 20 minutes et bloquantes avec du tampon salin tamponné au phosphate-albumine de sérum bovin ( PBS-BSA) 3% pendant 1 heure à température ambiante. L'hybridation avec des anticorps primaires spécifiques (dilués dans du PBS-BSA 1%) sera réalisée pendant une nuit à 4 ºC puis, des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores AlexaFluor seront incubés pendant 1 heure dans l'obscurité à température ambiante. Les échantillons colorés seront transférés la lamelle sur une lame de microscope et conservés dans un milieu de montage à fluorescence anti-décoloration.

Les niveaux circulants de cytokines, de molécules d'adhésion et de marqueurs sériques du stress oxydatif seront mesurés dans des échantillons de sérum, mais pour les études de sécrétome, 1x10^6 PBMC seront préalablement incubées dans 1 ml de RPMI avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) pendant 4 heures (37° C, 5% CO2) pour obtenir le surnageant. Les sérums et les surnageants seront analysés avec un système d'analyse Luminex® 200 en suivant la procédure du fabricant du kit Milliplex® MAP. Ces mêmes déterminations seront effectuées sur des échantillons de GCF et de sérum/plasma de patients.

La quantification des autophagosomes fonctionnels dans les PBMC sera réalisée par cytométrie en flux sur notre équipement BD Accuri avec le kit de détection CYTO-ID® Autophagy suivant la procédure du fabricant. En parallèle, les leucocytes provenant d'échantillons de sang total seront incubés avec des sondes fluorescentes détectant le statut redox pendant 15 minutes, puis ils seront analysés par cytométrie en flux. De plus, des panneaux multicolores pour la cytométrie en flux basés sur la détection d'antigènes de différenciation (CD), CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 et CD14/CD16, seront conçus pour analyser le pourcentage de sous-populations de lymphocytes T (cellules T naïves (TN), mémoire centrale (TCM), cellules effectrices à mémoire (TEM) et cellules terminalement différenciées (TEMRA)) et sous-populations de monocytes (classiques, non classiques et intermédiaires), respectivement dans des échantillons de sang. Dans les deux procédures, 10 000 événements seront acquis et des contrôles de coloration unique et FMO pour tous les anticorps conjugués aux fluorochromes dans les panels seront effectués pour établir une compensation adéquate et définir des signaux positifs.

Une chambre à flux parallèle à plaques, reliée à un microscope inversé, permettra aux chercheurs de mesurer les interactions neutrophiles-cellules endothéliales in vitro. Grâce à ce système, la suspension de leucocytes obtenue auprès des patients sera perfusée sur une monocouche de cellules endothéliales immortalisées (HUVEC/TERT 2) dans des conditions simulant le flux sanguin. Les vidéos seront ensuite analysées pour déterminer le débit, la vitesse de roulement et la ferme adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales, comme décrit précédemment (Antioxydants. 11 août 2020;9(8):734).

Les changements dans les niveaux d'expression génique seront évalués à l'aide de la technologie Nanostring® pour nCounter®. Pour résumer, l'ARN total sera extrait des PBMC à l'aide du kit total GeneAllR RibospinTM, et à partir de 100 à 200 ng d'ARN total, Diagnostica Longwood, S.L. analysera la réponse différentielle de l'expression génique, obtenant ainsi le panel de métabolisme multiplex.

Pour l'analyse différentielle de l'expression génique des miARN (DEG), l'ARN sera extrait à l'aide du kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). Après l'extraction de l'ARN à chaîne courte, les bibliothèques seront préparées pour le séquençage à l'aide du kit de préparation de bibliothèques TruSeq Small RNA (Illumina, Inc). Les bibliothèques seront regroupées de manière équimolaire et quantifiées à l'aide du kit KAPA SYBR FAST Universal qPCR avec Illumina Primer Premix, et la taille du groupe sera mesurée à l'aide d'un bioanalyseur (Agilent). Enfin, 2 nanomoles du groupe seront séquencées sur la plateforme Illumina NovaSeq6000 avec un contrôle PhiX 1% dans les installations FISABIO. Les bibliothèques seront séquencées en utilisant une chimie de 2 x 100 pb dans une Flow Cell SP (Illumina, Inc). Après multiplexage, les données brutes seront traitées à l'aide du pipeline « COMPSRA : a COMPrehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis ».

L'ADN sera également extrait du plasma selon le « protocole de sang et de fluides corporels » de l'ensemble de réactifs sanguins QIAamp (QIAgen, Hilden, Allemagne) ; 400 μL de plasma seront appliqués sur chaque colonne, l'ADN sera élué dans 200 μL de tampon fourni et sera conservé à -20°C jusqu'à utilisation. L'ADNmt sera quantifié par réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR) en utilisant des amorces spécifiques pour obtenir les niveaux d'ADNmt en circulation.

L'analyse des données sera effectuée avec SPSS 17.0. Les groupes seront comparés à l'aide de tests t de Student non appariés ou de tests U de Mann-Whitney pour les données paramétriques et non paramétriques, respectivement. Les changements après l'intervention seront évalués à l'aide de tests t de Student appariés ou de tests de Wilcoxon, en fonction de la distribution variable. Les coefficients de corrélation de Pearson ou Spearman seront utilisés pour mesurer la force de l'association entre les variables. Dans les modèles de régression multivariée, la relation entre deux ou plusieurs variables explicatives (variables indépendantes) et une variable de réponse (variable dépendante) sera évaluée en ajustant une équation linéaire aux données obtenues. Les données qualitatives seront exprimées en pourcentages et les proportions seront comparées à l'aide d'un test du chi carré. Tous les tests utiliseront un intervalle de confiance de 95 % et les différences seront considérées comme statistiquement significatives lorsque p <0,05.