Efecto del tratamiento periodontal no quirúrgico sobre el sistema inmunológico desde una perspectiva de género

Se recolectarán muestras de sangre, líquido crevicular gingival (GCF) y saliva de los pacientes al inicio del estudio y 12 semanas después del tratamiento periodontal no quirúrgico. A partir de muestras de sangre en ayunas (12 h), se aislarán células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y fracciones de neutrófilos mediante un método inmunomagnético, siguiendo el protocolo del fabricante, y el plasma y el suero se almacenarán a -80 °C hasta su análisis. LUNA-FL se utilizará para determinar el recuento celular y la viabilidad (doble tinción con naranja de acridina y yoduro de propidio) en muestras celulares. Las muestras de GCF se recolectarán por duplicado insertando con cuidado puntas de papel estériles en la bolsa periodontal de 1 mm durante 30 s. El volumen se determinará utilizando el Periotron 8000 y se almacenará a -80 °C para determinaciones futuras. La saliva no estimulada se recolectará en tubos libres de ARNasa mediante expectoración y, después de la centrifugación, el sobrenadante se almacenará a -80 ° C para el análisis de microARN (miARN).

Los parámetros periodontales clínicos de profundidad de las bolsas de sondaje (PD), milímetros de nivel de inserción clínica (CAL), sangrado al sondaje (BOP), índice de placa simplificado de Silness y Löe e índice de cálculo simplificado de Greene y Vermillion se determinarán utilizando un manual convencional. sonda periodontal (UNC-15 PCP). Se realizará un examen periodontal para medir PD, CAL y BOP en seis sitios por diente para todos los dientes, excluidos los terceros molares, como se describió anteriormente. Los pacientes serán entrevistados sobre su historial médico, hábitos de estilo de vida (tabaquismo, frecuencia de cepillado de dientes, actividad física) y características sociodemográficas. El peso, la altura y la presión arterial se medirán utilizando métodos estandarizados. Parámetros bioquímicos del metabolismo de los carbohidratos - glucosa, insulina, hemoglobina glucosilada (A1c) -, perfil lipídico - colesterol total, LDL, HDL, triglicéridos (TG), apolipoproteínas AI y B -, marcadores emergentes de riesgo inflamatorio y cardiovascular - Proteína C Reactiva ( PCR), C3c y proteína 4 fijadora de retinol (RBP4) -, y el hemograma completo se determinará en el Servicio de Análisis Clínicos del hospital.

Para la detección de diferencias en la expresión de proteínas, las células se incubarán en tampón de lisis con inhibidores de proteasas y fosfatasas (tampón RIPA) durante 15 minutos a 4 grados centígrados (°C). El sobrenadante se recogerá tras centrifugación durante 15 minutos a 16.000 g. La concentración de proteína total se cuantificará mediante un ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA). Se resolverán alícuotas de 25 µg de proteína en geles de SDS-poliacrilamida con gradiente de 8-16% y se transferirán a membranas de nitrocelulosa. Las proteínas diana se detectarán incubando las membranas con antiactina, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, procaspasa 1, caspasa 1, NADPH oxidasa, catalasa, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62. , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alpha, ATF6, CHOP, PGC1 alpha, mTFA, VDAC, Complex I, II, III, IV y V. La señal proteica se detectará mediante quimioluminiscencia y se analizará mediante densitometría.

El ensamblaje del complejo inflamasoma (primera etapa de activación) mediante estudios de colocalización de NLRP3-ASC en PBMC se llevará a cabo utilizando microscopía confocal y/o de fluorescencia. Brevemente, las PBMC se sembrarán en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, se fijarán con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 minutos, se permeabilizarán con Triton X-100 durante 20 minutos y se bloquearán con tampón salino tamponado con fosfato-albúmina de suero bovino ( PBS-BSA) 3% durante 1 hora a temperatura ambiente. La hibridación con anticuerpos primarios específicos (diluidos en PBS-BSA al 1%) se realizará durante la noche a 4 ºC y luego, los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos AlexaFluor se incubarán durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Las muestras teñidas se transferirán con el cubreobjetos al portaobjetos del microscopio y se conservarán en un medio de montaje de fluorescencia antidesvanecimiento.

Los niveles circulantes de citocinas, moléculas de adhesión y marcadores de estrés oxidativo sérico se medirán en muestras de suero, pero para estudios de secretoma se incubarán previamente 1x10^6 PBMC en 1 ml de RPMI con suero bovino fetal (FBS) al 10% durante 4 horas (37° C, 5% CO2) para obtener el sobrenadante. Tanto los sueros como los sobrenadantes se analizarán con un sistema analizador Luminex® 200 siguiendo el procedimiento del fabricante del kit Milliplex® MAP. Estas mismas determinaciones se realizarán en GCF y muestras de suero/plasma de pacientes.

La cuantificación de autofagosomas funcionales en PBMC se realizará mediante citometría de flujo en nuestro equipo BD Accuri con el kit de detección de autofagia CYTO-ID® siguiendo el procedimiento del fabricante. Paralelamente, los leucocitos de muestras de sangre completa se incubarán con sondas fluorescentes que detectan el estado redox durante 15 minutos y luego se analizarán mediante citometría de flujo. Además, se diseñarán paneles multicolores para citometría de flujo basados ​​en la detección de antígenos de diferenciación (CD), CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 y CD14/CD16, para analizar el porcentaje de subpoblaciones de linfocitos T (células T vírgenes). (TN), memoria central (TCM), memoria efectora (TEM) y células terminalmente diferenciadas (TEMRA) y subpoblaciones de monocitos (clásicas, no clásicas e intermedias), respectivamente en muestras de sangre. En ambos procedimientos se adquirirán 10000 eventos y se realizarán tinciones únicas y controles FMO para todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo en los paneles para establecer una compensación adecuada y definir señales positivas.

Una cámara de flujo de placas paralelas, conectada a un microscopio invertido, permitirá a los investigadores medir las interacciones entre neutrófilos y células endoteliales in vitro. Mediante este sistema, la suspensión de leucocitos obtenida de los pacientes se perfundirá sobre una monocapa de células endoteliales inmortalizadas (HUVEC/TERT 2) en condiciones que simulen el flujo sanguíneo. Posteriormente se analizarán los videos para determinar el flujo, la velocidad de rodadura y la adhesión firme de los leucocitos a las células endoteliales, como se describió anteriormente (Antioxidantes. 11 de agosto de 2020; 9 (8): 734).

Los cambios en los niveles de expresión genética se evaluarán utilizando la tecnología Nanostring® para nCounter®. En resumen, se extraerá el ARN total de las PBMC mediante el kit total GeneAllR RibospinTM, y partiendo de 100-200 ng de ARN total, Diagnostica Longwood, S.L. Se analizará la respuesta diferencial de expresión génica, obteniendo así el panel de metabolismo multiplex.

Para el análisis diferencial de la expresión génica de miARN (DEG), el ARN se extraerá utilizando el kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). Después de la extracción de ARN de cadena corta, las bibliotecas se prepararán para la secuenciación utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño TruSeq (Illumina, Inc). Las bibliotecas se agruparán de forma equimolar y se cuantificarán utilizando el kit KAPA SYBR FAST Universal qPCR con Illumina Primer Premix, y el tamaño del grupo se medirá utilizando un bioanalizador (Agilent). Finalmente, se secuenciarán 2 nanomoles del grupo en la plataforma Illumina NovaSeq6000 con un control PhiX al 1% en las instalaciones de FISABIO. Las bibliotecas se secuenciarán utilizando química de 2x100 pb en una celda de flujo SP (Illumina, Inc). Después de la multiplexación, los datos sin procesar se procesarán utilizando la canalización "COMPSRA: una plataforma integral para análisis de datos Small RNA-Seq".

El ADN también se extraerá del plasma de acuerdo con el "protocolo de sangre y fluidos corporales" del conjunto de reactivos de sangre QIAamp (QIAgen, Hilden, Alemania); Se aplicarán 400 μL de plasma a cada columna, el ADN se eluirá en 200 μL del tampón suministrado y se almacenará a -20 °C hasta su uso. El ADNmt se cuantificará con reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) utilizando cebadores específicos para obtener niveles de ADNmt circulante.

El análisis de datos se realizará con SPSS 17.0. Los grupos se compararán mediante pruebas t de Student no pareadas o pruebas U de Mann-Whitney para datos paramétricos y no paramétricos, respectivamente. Los cambios después de la intervención se evaluarán mediante pruebas t de Student pareadas o pruebas de Wilcoxon, según la distribución de la variable. Se utilizarán coeficientes de correlación de Pearson o Spearman para medir la fuerza de asociación entre variables. En los modelos de regresión multivariable, la relación entre dos o más variables explicativas (variables independientes) y una variable respuesta (variable dependiente) se evaluará ajustando una ecuación lineal a los datos obtenidos. Los datos cualitativos se expresarán en porcentajes y las proporciones se compararán mediante una prueba de Chi-cuadrado. Todas las pruebas utilizarán un intervalo de confianza del 95% y las diferencias se considerarán estadísticamente significativas cuando p <0,05.