Auswirkung einer nicht-chirurgischen Parodontalbehandlung auf das Immunsystem aus geschlechtsspezifischer Sicht

Blut, Zahnfleischspaltenflüssigkeit (GCF) und Speichelproben werden den Patienten zu Studienbeginn und 12 Wochen nach der nicht-chirurgischen parodontalen Behandlung entnommen. Aus Nüchternblutproben (12 Stunden) werden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) und Neutrophilenfraktionen mithilfe einer immunomagnetischen Methode gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Plasma und Serum werden bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. LUNA-FL wird zur Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit (Doppelfärbung mit Acridinorange und Propidiumiodid) in Zellproben verwendet. GCF-Proben werden in zweifacher Ausfertigung gesammelt, indem sterile Papierspitzen 30 s lang vorsichtig 1 mm in die Parodontaltasche eingeführt werden. Das Volumen wird mit dem Periotron 8000 bestimmt und für zukünftige Bestimmungen bei -80 °C gelagert. Nicht stimulierter Speichel wird durch Auswurf in RNase-freien Röhrchen gesammelt und nach der Zentrifugation wird der Überstand bei -80 °C für die microRNA (miRNA)-Analyse gelagert.

Klinische parodontale Parameter der Sondierungstaschentiefe (PD), Millimeter des klinischen Bindungsgrads (CAL), Blutung beim Sondieren (BOP), vereinfachter Plaque-Index von Silness und Löe und vereinfachter Zahnsteinindex von Greene und Vermillion werden mithilfe eines herkömmlichen Handbuchs bestimmt Parodontalsonde (UNC-15 PCP). Es wird eine parodontale Untersuchung durchgeführt, um PD, CAL und BOP an sechs Stellen pro Zahn für alle Zähne zu messen, mit Ausnahme der dritten Molaren, wie zuvor beschrieben. Die Patienten werden zu ihrer Krankengeschichte, ihren Lebensgewohnheiten (Rauchen, Häufigkeit des Zähneputzens, körperliche Aktivität) und soziodemografischen Merkmalen befragt. Gewicht, Größe und Blutdruck werden mit standardisierten Methoden gemessen. Biochemische Parameter des Kohlenhydratstoffwechsels – Glukose, Insulin, glykiertes Hämoglobin (A1c) –, Lipidprofil – Gesamtcholesterin, LDL, HDL, Triglyceride (TG), Apolipoproteine ​​AI und B –, neu auftretende Entzündungs- und kardiovaskuläre Risikomarker – C-reaktives Protein ( CRP), C3c und Retinol-bindendes Protein 4 (RBP4) sowie ein großes Blutbild werden im Clinical Analysis Service des Krankenhauses bestimmt.

Um Unterschiede in der Proteinexpression festzustellen, werden die Zellen 15 Minuten lang bei 4 Grad Celsius (°C) in Lysepuffer mit Protease- und Phosphataseinhibitoren (RIPA-Puffer) inkubiert. Der Überstand wird nach 15-minütiger Zentrifugation bei 16.000 g gesammelt. Die Gesamtproteinkonzentration wird mithilfe eines Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassays quantifiziert. Aliquots von 25 µg Protein werden auf SDS-Polyacrylamidgelen mit einem Gradienten von 8–16 % aufgelöst und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Zielproteine ​​werden durch Inkubation der Membranen mit Anti-Actin, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, Procaspase 1, Caspase 1, NADPH-Oxidase, Katalase, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 nachgewiesen , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alpha, ATF6, CHOP, PGC1 alpha, mTFA, VDAC, Komplex I, II, III, IV und V. Das Proteinsignal wird durch Chemilumineszenz erfasst und durch Densitometrie analysiert.

Der Aufbau des Inflammasom-Komplexes (erste Stufe der Aktivierung) durch Co-Lokalisierungsstudien von NLRP3-ASC in PBMCs wird unter Verwendung der konfokalen und/oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Kurz gesagt werden PBMCs auf mit Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser ausgesät, 20 Minuten lang mit Paraformaldehyd (PFA) 4 % fixiert, 20 Minuten lang mit Triton X-100 permeabilisiert und mit phosphatgepuffertem Salzpuffer-Rinderserumalbumn blockiert ( PBS-BSA) 3 % für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Hybridisierung mit spezifischen Primärantikörpern (verdünnt in PBS-BSA 1 %) wird über Nacht bei 4 °C durchgeführt und anschließend werden mit AlexaFluor-Fluorophoren konjugierte Sekundärantikörper 1 Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Gefärbte Proben werden mit dem Deckglas auf einen Objektträger übertragen und in einem lichtbeständigen Fluoreszenz-Eindeckmedium konserviert.

In Serumproben werden die zirkulierenden Mengen an Zytokinen, Adhäsionsmolekülen und Markern für oxidativen Stress im Serum gemessen, aber für Sekretomstudien werden 1x10^6 PBMCs zuvor 4 Stunden lang in 1 ml RPMI mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) inkubiert (37 °C). C, 5 % CO2), um den Überstand zu erhalten. Sowohl Seren als auch Überstände werden mit einem Luminex® 200-Analysesystem gemäß dem Verfahren des Milliplex® MAP Kit-Herstellers analysiert. Dieselben Bestimmungen werden an GCF- und Serum-/Plasmaproben von Patienten durchgeführt.

Die Quantifizierung funktioneller Autophagosomen in PBMCs wird mithilfe der Durchflusszytometrie auf unserem BD Accuri-Gerät mit dem CYTO-ID® Autophagie-Nachweiskit gemäß dem Verfahren des Herstellers durchgeführt. Parallel dazu werden Leukozyten aus Vollblutproben 15 Minuten lang mit Fluoreszenzsonden zur Redoxstatuserkennung inkubiert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert. Darüber hinaus wird ein mehrfarbiges Panel für die Durchflusszytometrie basierend auf dem Cluster-of-Differenzierungs-Antigen-Nachweis (CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 und CD14/CD16) entwickelt, um den Prozentsatz der Lymphozyten-T-Subpopulationen (naive T-Zellen) zu analysieren (TN), zentrales Gedächtnis (TCM), Effektorgedächtnis (TEM) und terminal differenzierte (TEMRA) Zellen) bzw. Monozyten-Subpopulationen (klassisch, nicht-klassisch und intermediär) in Blutproben. Bei beiden Verfahren werden 10.000 Ereignisse erfasst und Einzelfärbungen und FMO-Kontrollen für alle Fluorochrom-konjugierten Antikörper in den Panels durchgeführt, um eine angemessene Kompensation zu gewährleisten und positive Signale zu definieren.

Eine Parallelplatten-Durchflusskammer, verbunden mit einem Umkehrmikroskop, wird es den Forschern ermöglichen, die Wechselwirkungen zwischen Neutrophilen und Endothelzellen in vitro zu messen. Durch dieses System wird die von Patienten gewonnene Leukozytensuspension unter Bedingungen, die den Blutfluss simulieren, über eine Monoschicht immortalisierter Endothelzellen (HUVEC/TERT 2) perfundiert. Anschließend werden die Videos analysiert, um den Fluss, die Rollgeschwindigkeit und die feste Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen zu bestimmen, wie zuvor beschrieben (Antioxidantien). 11.08.2020;9(8):734).

Änderungen der Genexpressionsniveaus werden mithilfe der Nanostring®-Technologie für nCounter® ausgewertet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gesamt-RNA aus PBMCs mit dem GeneAllR RibospinTM-Gesamtkit extrahiert wird, und zwar ab 100–200 ng Gesamt-RNA, Diagnostica Longwood, S.L. wird die differenzielle Genexpressionsreaktion analysieren und so das Multiplex-Metabolismus-Panel erhalten.

Für die differenzielle Genexpressionsanalyse von miRNAs (DEGs) wird RNA mit dem miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) extrahiert. Nach der Extraktion kurzkettiger RNA werden die Bibliotheken mithilfe des TruSeq Small RNA-Bibliotheksvorbereitungskits (Illumina, Inc.) für die Sequenzierung vorbereitet. Bibliotheken werden äquimolar gepoolt und mit dem KAPA SYBR FAST Universal qPCR-Kit mit Illumina Primer Premix quantifiziert, und die Gruppengröße wird mit einem Bioanalyzer (Agilent) gemessen. Schließlich werden 2 Nanomol der Gruppe auf der Illumina NovaSeq6000-Plattform mit einer 1 % PhiX-Kontrolle in den FISABIO-Einrichtungen sequenziert. Bibliotheken werden mithilfe einer 2x100-bp-Chemie in einer SP-Durchflusszelle (Illumina, Inc) sequenziert. Nach dem Multiplexen werden die Rohdaten mit der Pipeline „COMPSRA: a COMPrehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis“ verarbeitet.

DNA wird auch gemäß dem „Blut- und Körperflüssigkeitsprotokoll“ des QIAamp-Blutreagenziensets (QIAgen, Hilden, Deutschland) aus Plasma extrahiert; Auf jede Säule werden 400 μl Plasma aufgetragen, die DNA wird in 200 μl des mitgelieferten Puffers eluiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. mtDNA wird mit der Reverse-Transkription-quantitativen Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung spezifischer Primer quantifiziert, um zirkulierende mtDNA-Spiegel zu erhalten.

Die Datenanalyse wird mit SPSS 17.0 durchgeführt. Die Gruppen werden mithilfe ungepaarter Student-T-Tests oder Mann-Whitney-U-Tests für parametrische bzw. nichtparametrische Daten verglichen. Änderungen nach der Intervention werden je nach Variablenverteilung mithilfe gepaarter Student-T-Tests oder Wilcoxon-Tests bewertet. Korrelationskoeffizienten nach Pearson oder Spearman werden verwendet, um die Stärke der Assoziation zwischen Variablen zu messen. In multivariablen Regressionsmodellen wird die Beziehung zwischen zwei oder mehr erklärenden Variablen (unabhängigen Variablen) und einer Antwortvariablen (abhängigen Variablen) ausgewertet, indem eine lineare Gleichung an die erhaltenen Daten angepasst wird. Qualitative Daten werden in Prozent ausgedrückt und die Anteile werden mithilfe eines Chi-Quadrat-Tests verglichen. Bei allen Tests wird ein Konfidenzintervall von 95 % verwendet und Unterschiede gelten als statistisch signifikant, wenn p < 0,05.